Abstract
Il test del papillomavirus ad alto rischio (HR-HPV) combinato con la citologia migliora la rilevazione delle lesioni cervicali e aumenta la lunghezza degli intervalli di screening. Per un sondaggio HR-HPV basato sulla popolazione, l’automazione dei test è molto necessaria. Il sistema di test HPV Cobas 4800 è un test completamente automatizzato in grado di rilevare simultaneamente HPV16, HPV18 e altri 12 genotipi HR-HPV raggruppati. Questo sistema è stato impiegato per lo screening HR-HPV in un certo numero di paesi; tuttavia, tale applicazione in una grande popolazione in Cina non è stata documentata. In questo studio, abbiamo utilizzato il sistema di test HPV Cobas 4800 per rilevare HR-HPV in campioni di citologia cervicale raccolti da un totale di 5650 donne asintomatiche provenienti da una regione della Cina meridionale. Abbiamo riportato quanto segue: (1) la prevalenza dei 14 genotipi di HR-HPV era del 12,96%; (2) per quelli con infezione da HR-HPV, il 2,25% era positivo per HPV16, lo 0,50% per HPV18, il 9,15% per i 12 tipi di HPV raggruppati e l ‘ 1,06% per l’infezione multipla da HPV; e (3) non c’era differenza significativa nella prevalenza HR-HPV tra i diversi gruppi di età. HPV16 e HPV18 hanno dimostrato di essere i tipi predominanti di HPV presenti nei pazienti con cancro cervicale in alcune regioni della Cina, indicando che un test completamente automatizzato come il sistema di test HPV Cobas 4800 è particolarmente utile per lo screening HR-HPV basato sulla popolazione in queste regioni poiché questo test può rilevare contemporaneamente HPV16 e HPV18.
1. Introduzione
Il papillomavirus umano (HPV) è un virus a DNA a doppio filamento della famiglia Papillomaviridae . Ci sono più di 200 genotipi di HPV che sono stati identificati, tra cui 15 (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, e 82) sono altamente associati al cancro cervicale . Il cancro cervicale è il quarto cancro più comune nelle donne in tutto il mondo e il sesto cancro più comune nelle donne in Cina . Per ridurre l’onere del cancro cervicale, l’identificazione precoce delle lesioni cervicali che probabilmente progrediscono verso il cancro invasivo è di fondamentale importanza. La citologia cervicale svolge un ruolo importante nella prevenzione del cancro cervicale . L’aggiunta del test HPV alla citologia determina un aumento della rilevazione di lesioni cervicali di alto grado e si raccomanda pertanto che lo screening dell’HPV ad alto rischio (HR-HPV) sia incorporato nella citologia per migliorare la rilevazione della malattia e aumentare la lunghezza degli intervalli di screening .
Ad oggi, sono stati riportati vari metodi per la genotipizzazione e il rilevamento dell’HPV . Per lo screening basato sulla popolazione, l’automazione dei test è particolarmente utile in quanto l’automazione possiede la capacità di elaborare un gran numero di campioni in breve tempo e ridurre gli errori umani che possono verificarsi nelle operazioni manuali. Il sistema di test HPV Cobas 4800 (Roche Molecular Systems Inc., Rotkreuz, Svizzera), completamente automatizzato, è progettato per rilevare simultaneamente un totale di 14 tipi HR-HPV: HPV16 individualmente, HPV18 individualmente e 12 genotipi HR-HPV raggruppati (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, e 68). Questo sistema è stato approvato dalla Food and Drug Administration degli Stati Uniti per lo screening HR-HPV. Il sistema di test HPV Cobas 4800 è composto da 2 parti, ovvero, uno strumento Cobas x 480 che viene utilizzato per l’automazione della purificazione dell’acido nucleico e del pipettaggio del campione PCR e un analizzatore Cobas z 480 che è per l’amplificazione automatica in tempo reale della PCR e la successiva ibridazione specifica del tipo. Sebbene l’uso del sistema Cobas 4800 per il test HR-HPV sia stato segnalato in un certo numero di paesi , tale applicazione in una grande popolazione in Cina non è stata documentata. In questo studio, abbiamo utilizzato il sistema di test HPV Cobas 4800 per rilevare HR-HPV in campioni di citologia cervicale raccolti da un totale di donne asintomatiche 5650.
2. Metodi
Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione della ricerca medica dell’ospedale di Zhongshan della medicina tradizionale cinese. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti.
2.1. Raccolta del campione cervicale
Donne asintomatiche di età compresa tra 20 e 65 anni sono state arruolate da gennaio 2018 a dicembre 2018 per questo studio con il costo del test coperto dai soggetti dello studio o dai loro datori di lavoro o in combinazione. I criteri di inclusione includono essere 20 anni o più, non essere incinta, avere utero intatto, essere sessualmente attivi, o avere una storia di attività sessuale. Tutti i soggetti sono stati informati di non usare farmaci vaginali, contraccettivi vaginali o lubrificanti per 48 ore prima del campionamento cervicale. I campioni di citologia cervicale sono stati raccolti utilizzando il dispositivo Cervex-Brush Combi (Rovers Medical Devices) come segue: la parte di campionamento endocervicale del dispositivo è stata inserita nel canale endocervicale per consentire alle setole laterali di contattare completamente l’ectocervice e il dispositivo è stato quindi ruotato di due giri in senso orario. Dopo il ritiro, il dispositivo con le cellule raccolte è stato immediatamente inserito in un flaconcino contenente la soluzione PreservCyt (Hologic Inc., Bedford, MA, USA) e vigorosamente roteato. I campioni sono stati utilizzati per il rilevamento del DNA HPV come descritto di seguito.
2.2. Rilevamento HR-HPV Utilizzando il sistema di test HPV Cobas 4800
Tampone di lisi, tampone di lavaggio, tampone di eluizione, kit di controllo HPV positivo e negativo e tutti gli altri reagenti sono stati acquistati da Roche Molecular Systems Inc. Ogni campione aveva un controllo interno, β-globina, per monitorare l’adeguatezza cellulare, e ogni corsa comprendeva una serie di controlli positivi e negativi HPV. L’estrazione e la purificazione del DNA sono state effettuate con lo strumento Cobas x 480 secondo le istruzioni del produttore. In breve, i campioni di soluzione ConservCyt sono stati sottoposti a vortice e posizionati sul supporto del campione, e i reagenti, ad esempio, Tampone di lisi, tampone di lavaggio e tampone di eluizione, sono stati caricati nei rispettivi serbatoi dei reagenti. Dopo il caricamento del campione e del reagente, la preparazione del DNA è stata completata automaticamente e i prodotti finali del DNA sono stati raccolti in una piastra di microwell. Successivamente, la piastra microwell contenente DNA è stata sigillata manualmente e caricata sull’analizzatore Cobas z 480 e l’amplificazione e l’ibridazione sono state completate automaticamente.
2.3. Analisi statistica
L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando SPSS 13.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA). Il test χ2 è stato utilizzato per valutare le variabili categoriali. Tutti i test statistici erano a 2 lati e valori inferiori a 0,05 erano considerati statisticamente significativi.
3. Risultati
Un totale di 5650 donne asintomatiche di età compresa tra 20 e 65 anni con un’età media di anni ha soddisfatto i requisiti dello studio e sono state incluse in questo studio. Di questi partecipanti, 732 (12.96%) sono stati rilevati come HR-HPV-positivi, tra cui il 127 (2.25%) con infezione da HPV16, 28 (0.50%) con HPV18, 517 (9.15%) con un pool di 12 tipi di HPV, e 60 (1.06%) con più infezione da HPV (HPV16 mescolato con HPV18, HPV16 misto con 12 pool tipi, HPV18 misto con 12 pool tipi, o HPV16 mescolato con HPV18 e 12 pool tipi) (Tabella 1).
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Le infezioni multiple da HPV includono HPV16 miscelato con HPV18, HPV16 miscelato con 12 tipi raggruppati, HPV18 miscelato con 12 tipi raggruppati, o HPV16 miscelato con HPV18 e 12 tipi raggruppati.
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In base all’età, i partecipanti sono stati divisi in 4 gruppi: 20-30, 31-40, 41-50 e >51 anni. Come mostrato nella Tabella 2, il gruppo di 31-40 anni ha avuto il più alto tasso di infezione HR-HPV del 15,32% seguito dai gruppi di >50 anni, 41-50 anni e 20-30 anni, sebbene non sia stata osservata alcuna significatività statistica tra i tassi di infezione di questi gruppi.
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4. Discussione
In questo studio, abbiamo usato il sistema Cobas 4800 per rilevare HR-HPV in 5650 donne asintomatiche e abbiamo trovato quanto segue: (1) la prevalenza dei 14 genotipi di HR-HPV era del 12,96%; (2) delle 732 donne HR-HPV-positive, il 2,25% era positivo per HPV16, lo 0,50% per HPV18, il 9,15% per 12 tipi di HPV 1,06% per infezione multipla da HPV; e (3) non c’era differenza significativa nella prevalenza HR-HPV tra i diversi gruppi di età.
Sia il test HPV ad alto rischio in tempo reale di Abbott Molecular Inc. (Des Plaines, IL, USA) e il sistema di test HPV Cobas 4800 sono test clinici convalidati, completamente automatizzati basati su PCR per la rilevazione di HR-HPV . Un vantaggio di questi 2 saggi è che possono contemporaneamente rilevare e distinguere HPV16 e HPV18, che è importante per lo screening del cancro cervicale in quanto HPV16 e HPV18 rappresentano circa il 70% dei tumori cervicali a livello globale . Pochi studi hanno confrontato questi 2 saggi nel rilevare HR-HPV in campioni clinici. Parco et al. testato 365 campioni di tampone cervicale e ha riferito che il test HPV ad alto rischio in tempo reale presentava una sensibilità del 78,3% con una specificità del 99,2% mentre la sensibilità e la specificità del sistema Cobas 4800 erano rispettivamente del 91,7% e del 97,0%. Cuzick et al. ha esaminato 6000 donne e ha rivelato che il 16,0% è stato rilevato positivo all’HR-HPV dal sistema Cobas 4800 mentre il 13,4% è stato rilevato positivo all’HR-HPV dal test HPV ad alto rischio in tempo reale . Questi dati indicano che il sistema Cobas 4800 possiede una maggiore sensibilità di rilevamento.
Diversi sistemi molecolari clinicamente validati per la rilevazione del DNA HR-HPV sono stati inclusi dall’Organizzazione Mondiale della Sanità nel 2016 nel manuale Integrating HPV Testing in Cervical Cancer Screening Programs-a Manual for Program Manager (https://www.paho.org/hq/dmdocuments/2016/manual-VPH-English—FINAL-version.pdf). Questi test consistono in test basati sull’ibridazione, ovvero la tecnica Hybrid Capture 2 e il test CareHPV, e test basati sulla PCR, ad esempio, il Cobas HPV test, l’Abbott RealTime High Risk HPV test, il Cervista HPV HR test, e il test BD HPV. Tutti i test basati su PCR richiedono l’isolamento del DNA mentre i test basati sull’ibridazione non lo fanno. Di tutti i metodi, il test Cervista HPV HR richiede 6-7 ore e il test Abbott RealTime High Risk HPV richiede 6-8 ore per essere eseguito, il che potrebbe non soddisfare l’obiettivo di “vedere e trattare” lo stesso giorno. Al contrario, tutti i metodi rest compreso il sistema Cobas 4800, tuttavia, richiedono un tempo di esecuzione massimo di circa 5 ore, adatto ai pazienti per completare “vedere e trattamento” in una sola visita.
Globalmente, la prevalenza HR-HPV varia da continente a continente . In Cina, per l’indagine sulla prevalenza di HR-HPV, sono stati utilizzati diversi metodi . Wu et al. utilizzato il test Hybrid Capture 2 (Qiagen, Hilden, Germania) per la rilevazione di HR-HPV di 13 tipi raggruppati (HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, e 68) in un totale di 4215 donne di età compresa tra 17-54 anni provenienti da 5 diverse aree geografiche della Cina e hanno scoperto che la prevalenza di HR-HPV era del 12,4%. Usando lo stesso metodo di Wu et al. , Zhao et al. trovato che 15.il 2% delle 1274 donne di una regione del Nord della Cina è risultato positivo all’HR-HPV . Chen et al. impiegato un kit di genotipizzazione HPV (Yaneng Biotechnology Limited Corp., Shenzhen, Cina) per un totale di test HPV 961,029 per le donne di età compresa tra 16 e 83 anni dal sud-est della Cina e ha rivelato un tasso di infezione HR-HPV del 16,61% . Jing et al. applicato un test spettrometrico di massa per il test HPV-DNA in 78.355 donne di età compresa tra 18 e 75 anni del sud della Cina e riportato un tasso di prevalenza HR-HPV <7,3%. Questi studi dimostrano un tasso di infezione HR-HPV che varia di circa il 10-15% nelle donne cinesi, che è in accordo con la nostra scoperta. Tuttavia, il metodo che abbiamo utilizzato nel presente studio è più semplice e meno laborioso rispetto a quelli utilizzati nelle indagini precedenti .
Due studi con la più grande dimensione del campione condotti in Cina hanno confrontato i tassi di prevalenza HR-HPV tra i gruppi di età. Zeng et al. retrospettivamente analizzato 671.163 test HPV eseguiti utilizzando il metodo Hybrid Capture 2 dal 2007 al 2014 e ha dimostrato la più alta prevalenza HR-HPV di 36.9% nel gruppo di età < 20 anni mentre i tassi HR-HPV-positivi per i gruppi di età di 20-30, 30-40 e 40-50 anni erano rispettivamente del 24,4%, 19,7% e 19,9%. Test HR-HPV con la più grande dimensione del campione (961.029 campioni) effettuata da Chen et al. ancora una volta mostra il più alto tasso di prevalenza di HR-HPV nella fascia di età di <20 anni (22,3%) mentre i tassi di prevalenza per i gruppi di età di 20-30, 30-40 e 40-50 anni sono rispettivamente del 16,8%, 15,2% e 15,9%. Questi studi rivelano un tasso di prevalenza leggermente superiore nel gruppo di 20-30 anni rispetto ai gruppi di 30-40 e 40-50 anni, che è in contrasto con i nostri risultati, poiché abbiamo osservato la più bassa prevalenza HR-HPV nel gruppo di 20-30 anni. Questa discrepanza può verificarsi a causa dei seguenti fattori: (1) le donne più giovani al giorno d’oggi hanno più accesso ai programmi di educazione sanitaria, in particolare i programmi online che utilizzano dispositivi elettronici, e (2) le donne più giovani sono più desiderosi di imparare e accettare nuove conoscenze in materia di igiene e salute sessuale.
HPV16 è il tipo più comune di HR-HPV trovato in campioni cervicali di donne provenienti da Nord (Pechino e Henan, Shanxi, e Xinjiang Province), Sud-est (Shanghai e Zhejiang Province), e la Cina meridionale (Guangdong Province) regioni, con un tasso positivo che va da 1.5 a 3.6% , che è in linea con un 2.25% HPV16 tasso di infezione osservato nel nostro studio soggetti che sono da sud della Cina. HPV16 è responsabile di circa il 50% del cancro cervicale a livello globale . Mentre le informazioni sulla distribuzione del genotipo HR-HPV nei pazienti con cancro cervicale cinesi sono ancora limitate, Li et al. ha riferito che 1818 su 2309 pazienti con cancro cervicale (78,7%) della Cina occidentale erano positivi per HPV16 e circa il 90% di questi pazienti erano positivi per HPV16 e HPV18 . Un tasso di infezione del 53,2% per HPV16 e HPV18 è stato anche mostrato in 326 pazienti con cancro cervicale della provincia del Fujian nel sud-est della Cina . Questi dati indicano che HPV16 e HPV18 sono i tipi predominanti di HPV riscontrati nei pazienti con cancro cervicale in queste regioni. Un test completamente automatizzato come il sistema di test HPV Cobas 4800 in grado di rilevare e differenziare simultaneamente HPV16 e HPV18 sarà particolarmente utile per lo screening HR-HPV basato sulla popolazione in regioni con dominanza dell’infezione da HPV16 e HPV18.
Disponibilità dei dati
I dati utilizzati per supportare i risultati di questo studio sono disponibili presso l’autore corrispondente su richiesta.
Conflitti di interesse
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Contributi degli autori
SW, XH, QP e LZ hanno reclutato i partecipanti, raccolto campioni ed eseguito test. SW e JZ hanno scritto l’articolo. FM ha esaminato la letteratura ed eseguito analisi statistiche. JZ ha progettato lo studio, analizzato i dati e infine approvato il manoscritto.