François Clouet est né à Tours, fils du peintre de cour Jean Clouet. Jean Clouet était originaire du sud des Pays-Bas et probablement de la région de Bruxelles. François Clouet étudie auprès de son père. Il a hérité du surnom de son père « Janet » et est désigné comme tel dans certaines sources anciennes et dans la littérature plus ancienne.
La première référence à François Clouet est un document daté de décembre 1541 dans lequel le roi renonce au profit de la succession de François son père, qui avait échu à la couronne comme la succession d’un étranger. Dans ce document, le jeune Clouet aurait suivi de très près son père dans son art. Comme son père, il a occupé les fonctions de palefrenier de la chambre et de peintre ordinaire du roi, et en ce qui concerne le salaire, il a commencé là où son père l’avait laissé. De nombreux dessins sont attribués à cet artiste, souvent sans certitude parfaite. Il y a cependant plus à faire que dans le cas de son père.
Comme les louanges de François Clouet étaient chantées par les écrivains de l’époque, son nom a été soigneusement conservé de règne en règne, et il existe une tradition ancienne et ininterrompue dans l’attribution de bon nombre de ses tableaux. Il n’existe cependant aucune attestation originale de ses œuvres, ni aucun document connu qui garantirait les attributions habituellement acceptées. On lui attribue les portraits de François Ier aux Offices et au Louvre, ainsi que divers dessins les concernant.
Il a probablement également peint le portrait de Catherine de Médicis à Versailles et d’autres œuvres, et selon toute probabilité un grand nombre des dessins qui lui sont attribués étaient de sa main.
L’un de ses portraits les plus remarquables est celui de Marie, reine d’Écosse, un dessin à la craie de la Bibliothèque nationale, et de caractère similaire sont les deux portraits de Charles IX et celui à Chantilly de Marguerite de France. Son chef-d’œuvre est peut-être le portrait d’Élisabeth d’Autriche au Louvre.Cette pièce a fait une impression importante sur Claude Lévi-Strauss. Il a notamment inspiré sa théorie du modèle réduit, ou des œuvres d’art en tant que « modèles miniatures », et d’autres théories des œuvres d’art, dans son livre The Savage Mind.
Clouet résidait à Paris dans la rue de Ste Avoye dans le quartier du Temple, à proximité de l’Hôtel de Guise, et en 1568 est connu pour avoir été sous le patronage de Claude Gouffier de Boisy, Seigneur d’Oiron, et de son épouse Claude de Baune. Un autre fait avéré concernant François Clouet est qu’en 1571, il fut convoqué au bureau de la Cour de la Monnaie, et son avis fut pris sur la ressemblance au roi d’un portrait frappé par la monnaie. Il a préparé le masque mortuaire d’Henri II, comme en 1547 il avait pris un masque similaire du visage et des mains de François Ier, afin que l’effigie à utiliser lors des funérailles puisse être préparée à partir de ses dessins; et à chacune de ces occasions, il a exécuté le tableau à utiliser dans les décorations de l’église et les bannières pour la grande cérémonie.
Plusieurs miniatures sont considérées comme son œuvre, un portrait très remarquable étant la figure en demi-longueur d’Henri II dans la collection de J. Pierpont Morgan. Un autre de ses portraits est celui de François, duc d’Alençon dans la collection Jones au Victoria & Albert Museum. Catherine de Médicis décrit les efforts de Maistre Jamet (il a utilisé le nom de son père) sur le portrait d’Alençon à l’ambassadeur à Londres, Mothe Fénélon.Certaines représentations de membres de la famille royale qui se trouvaient dans la collection du Palais Hamilton et dans la vente de Magniac lui sont généralement attribuées.
Il mourut le 22 décembre 1572, peu après le massacre de la Saint-Barthélemy, et son testament, mentionnant sa sœur et ses deux filles illégitimes, et traitant de la disposition d’une quantité considérable de biens, existe toujours. Ses filles devinrent par la suite religieuses.