Le processus d’application de l’imagerie de CLARTÉ commence par un échantillon de tissu post-mortem. Ensuite, une série de traitements chimiques doit être appliquée pour atteindre la transparence, dans laquelle la teneur en lipides de l’échantillon est éliminée, tandis que la quasi-totalité des protéines et des acides nucléiques d’origine sont laissés en place. Le but de ceci est de rendre le tissu transparent et ainsi de se prêter à une étude microscopique détaillée de ses parties fonctionnelles constitutives (qui sont principalement des protéines et des acides nucléiques). Pour ce faire, la structure protéique préexistante doit être placée dans un échafaudage transparent qui la préserve, tandis que les composants lipidiques sont éliminés. Cet « échafaudage » est constitué de monomères d’hydrogel tels que l’acrylamide. L’ajout de molécules comme le formaldéhyde, le paraformaldéhyde ou le glutaraldéhyde peut faciliter la fixation de l’échafaudage aux protéines et aux acides nucléiques à conserver, et l’ajout de chaleur est nécessaire pour établir les liens réels entre les composants cellulaires et l’acrylamide.
Une fois cette étape terminée, les composants protéiques et nucléiques des cellules du tissu cible sont maintenus fermement en place, tandis que les composants lipidiques restent détachés. Les lipides sont ensuite éliminés au cours de 1 à 2 semaines de diffusion passive dans un détergent, ou accélérés par des méthodes électrophorétiques à seulement des heures à des jours. Lors de leur passage, les propriétés lipophiles du détergent lui permettent de capter et d’exciser les lipides rencontrés en cours de route. Les colorants lipophiles comme DiI sont éliminés, mais il existe des colorants lipophiles compatibles avec la CLARTÉ qui peuvent être fixés aux protéines voisines. La grande majorité des molécules non lipidiques, telles que les protéines et l’ADN, ne sont pas affectées par cette procédure, grâce au gel d’acrylamide et aux propriétés chimiques des molécules impliquées.
Comme indiqué dans l’article initial, le tissu se dilate au cours de ce processus, mais au besoin, il peut être restauré à ses dimensions initiales avec une dernière étape d’incubation dans une solution d’adaptation de l’indice de réfraction.
À cette étape du processus, l’échantillon a été entièrement préparé pour l’imagerie. Le contraste pour l’imagerie peut provenir de molécules fluorescentes endogènes, de marqueurs d’acide nucléique (ADN ou ARN) ou d’immunocoloration, par laquelle des anticorps qui se lient spécifiquement à une certaine substance cible sont utilisés. De plus, ces anticorps sont marqués avec des étiquettes fluorescentes qui sont la clé du résultat final de l’imagerie. Les méthodes d’imagerie confocales standard, à deux photons ou en feuille de lumière conviennent toutes pour détecter ensuite la fluorescence émise jusqu’à l’échelle de la localisation des protéines, ce qui donne les images finales très détaillées et tridimensionnelles produites par CLARITY.
Après qu’un échantillon a été immunisé pour une image, il est possible d’éliminer les anticorps et d’en appliquer de nouveaux, permettant ainsi à un échantillon d’être imité plusieurs fois et ciblant plusieurs types de protéines.