Claudin 1 i Brysttumorigenese: åbenbaring af en mulig Roman “Claudin High” – delmængde af brystkræft

abstrakt

Claudiner er hovedkomponenten i de stramme kryds i epitelceller og spiller som sådan en nøglerolle i den polariserede placering af ionkanaler, receptorer og celler til de forskellige membrandomæner. I den henseende er claudiner nødvendige for en harmonisk udvikling af et funktionelt epitel. Desuden har defekte stramme kryds været forbundet med udviklingen af neoplastisk fænotype i epitelceller. Nedbrydning af Celle-Celle interaktioner og deregulering af ekspressionen af junctional proteiner menes derfor at være vigtige trin i invasion og metastase. Flere undersøgelser tyder på, at claudinerne er store deltagere i brysttumorigenese. I dette papir, vi diskuterer nylige fremskridt i vores forståelse af claudins potentielle rolle 1 i brystkræft. Vi diskuterer også betydningen af en delmængde af østrogenreceptor negativ brystkræft, der udtrykker “høje” niveauer af claudin 1-proteinet. Vi foreslår, at claudin 1 fungerer både som en tumorundertrykker såvel som en tumorforstærker/facilitator i brystkræft.

1. Brystkræft

brystkræft er fortsat en af de mest diagnosticerede kræftformer blandt kvinder i Nordamerika . Baseret på molekylære, epidemiologiske og histologiske observationer er en morfologisk progressionsmodel for brystkræft blevet samlet inden for det sidste årti . Denne foreslåede model (figur 1) skitserer et kontinuum af læsioner, der beskriver en trinvis progression af brystkræft, fra epitelhyperplasi, gennem atypisk hyperplasi og duktalt karcinom in situ, til invasivt karcinom og til sidst metastatisk sygdom . På trods af mange fremskridt inden for diagnose og behandling af brystkræft forbliver metastase en uoverstigelig udfordring. Omkring 40% af kvinderne fejler i øjeblikket primære ledelsesstrategier for tidlig brystkræft og i sidste ende bukker under for sygdommen.

Figur 1

hypotetisk model for brysttumorigenese og progression. Den trinvise progression af brystkræft beskrives som et kontinuum af læsioner fra epitelhyperplasi til invasivt karcinom og til sidst metastase.

den komplekse karakter af sygdomspræsentationen og begrænsningerne ved identifikation af klinisk relevante undergrupper af patienter skaber store vanskeligheder for nuværende diagnostiske og terapeutiske strategier for brystkræft. En voksende forståelse af den heterogene karakter af denne sygdom stammer primært fra cDNA-mikroarray og immunhistokemiske undersøgelser, som har ført til en omdefinering af brystkræftundersæt . Til dato er der identificeret 5 forskellige brystkræftkategorier (tabel 1 ) baseret på er/PR-status, Her2, CK5/6 og EGFR-ekspression. Terapeutisk har disse undertyper vist sig at vise en lang række reaktioner på forskellige behandlinger . Luminal a-undertypen (tabel 1), som er mere følsom over for hormoner, har det mest gunstige resultat, mens Her2-og basalundertyperne, som ikke er følsomme over for hormoner, er mere aggressive, demonstrerer den værste prognose og har færre terapeutiske muligheder . Åbenbart vil den yderligere identifikation af forskellige undertyper af brystkræft give flere terapeutiske muligheder for at matche egenskaberne hos individuelle brystkræftpatienter, hvilket forbedrer vores evne til at begynde at tilbyde individualiseret behandling til patienter.

to hypotetiske modeller er blevet foreslået for at forklare udviklingen af brystkræftundertyper . I den første model, den lineære model, er oprindelsescellen den samme for forskellige tumorundertyper (og således bestemmes tumorundertypen af erhvervede genetiske og epigenetiske begivenheder). I den anden model, den ikke-lineære model, er oprindelsescellen forskellig (formodentlig en stamcelle eller en stamcelle) for de forskellige undertyper. Nyligt arbejde af Jeselsohn et al. har fremlagt beviser, der tyder på, at der er to populationer af stamceller, den ene giver anledning til luminal-lignende brystkræft og den anden til basal-lignende brystkræft.

2. Epithelial mesenkymal overgang (EMT)

erhvervelsen af den invasive fænotype menes at markere den mest signifikante ændring i brystkræftbiologi, da den repræsenterer det første skridt mod udvikling af metastatisk sygdom. Når celler konverteres fra den ikke-invasive til den invasive fænotype, bliver de forankringsuafhængige og udviser forbedret bevægelighed såvel som øget aggressivitet, en proces kaldet epithelial-mesenkymal overgang (EMT).

under denne overgang får epitelceller en mesenkymlignende fænotype via forstyrrelse af intercellulær adhæsion og forbedret motilitet (til gennemgang se ). Det antages, at celler skifter fra et keratin (epitel) rigt netværk til et vimentin (mesenkymalt) rigt netværk for at lette deres bevægelighed . Hvad angår mesenkymceller, kan de i modsætning til epithelceller individuelt migrere, trænge ind i omgivende væv og sprede sig til fjerne steder . Nedbrydningen af Celle-Celle-interaktioner og den deregulerede ekspression af de junctionelle proteiner menes derfor at være vigtige trin i invasion og metastase .

3. Stramme kryds

stramme kryds er de mest apikale af intercellulære kryds og fremstår som et netværk af kontinuerlige og anastomoserende filamenter på plasmamembranens protoplasmiske overflade (figur 2). De bidrager til den transepiteliale barriere, der styrer transporten af ioner og små molekyler gennem den paracellulære vej, en egenskab kaldet “barriere” – funktionen . Stramme kryds er også afgørende for organiseringen af epitelcellepolaritet, der adskiller plasmamembranen i apikale og basolaterale domæner . De er også kritiske for den polariserede placering af ionkanaler, receptorer og membraner til de membrandomæner, der er nødvendige for strukturelt og funktionelt udviklet epitel, en funktion kaldet “hegn” – funktionen . Stramme kryds er derfor vigtige for tæt forsegling af cellulære ark og opretholdelse af homeostase . Bortset fra at opretholde cellepolaritet og paracellulære funktioner er stramme krydsproteiner involveret i rekruttering af signalproteiner . Primært udgør tre typer integrale membranproteiner de stramme kryds (figur 2); claudinerne, occludin og det eller de krydsende adhæsionsmolekyler, hvor claudinerne og occludin er de to vigtigste molekylære komponenter til dannelse af den stramme forbindelsesstreng. Det junctionelle adhæsionsmolekyle antages at fungere som den indledende rumlige signal til dannelse af tæt kryds . I forbindelse med adheren-forbindelsesproteinerne, som er ansvarlige for den mekaniske adhæsion mellem tilstødende celler og stabiliseringen af hele den multicellulære arkitektur, udgør de det apikale junctionelle kompleks i epitelvæv .

Figur 2

Stramme Kryds. Stramme kryds er de mest apikale intercellulære kryds i epitelceller. De vigtigste molekylære komponenter i de stramme kryds er claudins, occludinog det junctionelle adhæsionsmolekyle (marmelade). Tight junction proteiner i forbindelse med adheren junction proteiner (cadheriner, cateniner) danner epitelcelle junctional komplekser . Gap-krydset er placeret basalt til adheren-krydset.

4. Tight Junction proteiner og tumorigenese

der er etableret en stærk sammenhæng mellem tight junction proteiner og cancer udvikling. Ændringer i strukturen og funktionen af stramme kryds er faktisk blevet rapporteret i adenocarcinomer i forskellige organer . Et fravær af stramme kryds eller defekte stramme kryds har også været forbundet med udviklingen af den neoplastiske fænotype i epitelceller . Sådanne observationer er i overensstemmelse med den accepterede ide om, at forstyrrelsen af stramme kryds fører til tab af samhørighed, invasivitet og manglen på differentiering og derved fremmer tumorigenese. I øjeblikket er mest viden om rollen som junctional proteiner i kræft, og mere specifikt brystkræft, stammer fra undersøgelser af det store adheren junction protein, E cadherin (til gennemgang se ). Nedreguleringen af E cadherin menes at være en vigtig molekylær begivenhed under epitel-mesenkymal overgang . I modsætning til E cadherin forstås rollen af de stramme knudeproteiner ikke godt i brystkræft.

4.1. Claudinerne

claudinerne er hovedkomponenten i det stramme kryds, og 24 medlemmer af denne familie af proteiner er blevet identificeret til dato . De er små proteiner i størrelse fra 22 Til 27 kD og kodes af mindst 17 humane gener (tabel 2), der er placeret på 12 forskellige kromosomer . Fordelingen af loci for claudin-generne blandt så mange forskellige kromosomer er interessant, da generelt mange genfamilier har de fleste, hvis ikke alle deres medlemmer placeret på et kromosom . Den brede fordeling kan afspejle de multifunktionelle egenskaber ved disse proteiner. Tre claudin-genklynger er let synlige på kromosom 3 (3k28), 4 (4k35.1) og 7 (7k11 .23), og det er meget sandsynligt, at medlemmer inden for disse klynger kan have lignende funktion og vævsspecificitet. Bortset fra disse tre claudin-genklynger synes der ikke at være noget andet indlysende mønster (tabel 2). Det er muligt, at udvidelsen af claudin-genfamilien hos mennesker kan have tilladt erhvervelse af nye funktioner under evolution, som postuleret for denne genfamilie i teleostfisk . Claudinerne deler en fælles transmembran topologi; hvert familiemedlem forventes at besidde fire transmembrane domæner med intracellulær amino og carboksyl-termini i cytoplasmaet og to ekstracellulære sløjfer . Ekspressionsmønsteret for claudinproteinerne er vævsspecifikt ; imidlertid udtrykker de fleste væv flere claudiner, der kan interagere på enten en homotypisk eller heterotypisk måde for at danne den stramme krydsstreng . Den nøjagtige kombination af claudinproteinerne i et givet væv bestemmer selektiviteten, styrken og tætheden af det stramme kryds .

til dato har kun få undersøgelser behandlet claudins rolle i brystkræft, og resultaterne af deres funktion forbliver kontroversielle . I flere kræftformer, herunder brystkræft, er ændret proteinekspression hos nogle claudin-familiemedlemmer blevet påvist (til gennemgang se ). For eksempel har proteinekspression af claudin 3 og 4 vist sig at være opreguleret i invasiv brystkræft, mens ekspressionen af claudin 1 og 7 proteiner også i invasiv brystkræft blev nedreguleret .

4.2. Claudin 1

Knockout-museksperimenter har fastslået, at det stramme knudeprotein claudin 1 og ikke occludin danner rygraden i den stramme knudestreng og er afgørende for den epidermale barrierefunktion . Udtryk af claudin 1 er blevet undersøgt i en række kræftformer (til gennemgang se ). Både en stigning og et fald i claudin 1-proteinekspression har vist sig at være forbundet med tumorigenese. I nogle kræftformer, herunder prostata , bryst og melanocytisk neoplasi , har tab af claudin 1 været forbundet med kræftprogression og invasion og erhvervelse af den metastatiske fænotype. I esophageal pladecellecarcinom faldt ekspression af claudin 1 korreleret med gentagelse og kortere sygdomsfri overlevelse, mens claudin 1 i lungekræft blev vist at undertrykke ekspressionen af invasion/metastaseforstærkere og øge ekspression af kræftinvasion/metastaseundertrykkere, hvorved der tilvejebringes dokumentation for, at det fungerer som en kræftinvasion/metastaseundertrykkende . Omvendt har overekspression af claudin 1 i andre kræftformer, såsom papillær skjoldbruskkirtel oral pladecellecarcinom , ovarie , tyktarm , melanom og gastrisk , været forbundet med aggressivitet og den øgede ondartede fænotype. Endvidere har funktionelle undersøgelser vist, at claudin 1 kunne rekruttere og fremme aktiveringen af metalloproteinase MMP-2 og føre til en mere aggressiv fænotype i oral og ovariecancer.

5. Claudin 1 i Normal bryst-og brystkræft

i den normale brystkirtel er stramme knudeproteiner hovedsageligt blevet undersøgt i forhold til lactogenese . Tidligere arbejde fra vores laboratorium har identificeret claudin 1 som et stærkt opreguleret gen under tidlig brystkirtelinvolution , og dets ekspression viste sig at være tæt reguleret i forskellige stadier af normal musekirteludvikling . For nylig har der været en øget interesse for claudin 1 ‘ s potentielle rolle i brystkræft. Selvom undersøgelser stadig er relativt begrænsede, er der et par kritiske rapporter, der viser en klar sammenhæng mellem claudin 1-ekspression og brystkræftprogression. De fleste undersøgelser peger på en nedregulering eller fuldstændigt tab af claudin 1-ekspression i ondartet invasiv human brystkræft og i nogle humane brystkræftcellelinjer . En sammenhæng mellem claudin 1 nedregulering og tilbagefald af sygdomme blev også for nylig rapporteret . Derudover antyder funktionelle undersøgelser også, at claudin 1 kan være en nøglespiller i brysttumorigenese. En nedregulering af claudin 1-genekspression viste sig at føre til neoplastisk transformation af brystepitelceller . Såvel, genudtrykket af claudin 1 alene viste sig at være tilstrækkelig til at inducere apoptose i en human brystkræftcellelinie . Det er også blevet foreslået, at claudin 1 alene kan være tilstrækkelig til at udøve en tæt kryds-medieret portfunktion i metastatiske tumorceller, selv i fravær af andre stramme krydsassocierede proteiner . Derudover har subcellulær lokalisering af claudin 1 vist sig (af os og andre ) at blive forstyrret i invasiv brystkræft, hvilket fører til en påvisning af dette protein i cytoplasmaet. Interessant nok er der for nylig etableret en sammenhæng mellem claudin 1 og epithelial mesenkymal overgang. Som med E cadherin blev transkriptionsfaktorerne, slug og snegl, nøglemarkører for epithelial mesenkymal overgang, vist at binde til claudin 1-promotoren, hvilket resulterede i undertrykkelse af dens aktivering .

yderligere arbejde fra vores laboratorium har også fremlagt bevis for, at claudin 1-ekspression i brystkræft er endnu mere kompleks end oprindeligt antaget. Ved hjælp af vævsmikroarray-strategier viste vi, at i en kohorte af humane invasive brystkræft, der udviser blandede patologiske læsioner (340 biopsier, den største undersøgte til dato), udtrykker kun en lille procentdel af tumorer claudin 1-protein. Hyppigheden af claudin 1 positive tumorer var signifikant lavere end hyppigheden af tumorer observeret som positiv for claudin 3 og 4, to familiemedlemmer, der tidligere viste sig at være overudtrykt i invasiv human brystkræft .

da ER-status ofte betragtes som en vigtig klassificering af brystkræft (tabel 1), ønskede vi at afgøre, om der var nogen sammenhæng mellem østrogen/østrogenreceptor og claudin 1. Vi viste, at i ERve brystkræft (189 biopsier) var et signifikant lille antal tumorer (5%) positive for claudin 1-ekspression, mens i ERve-tumorer (151 biopsier) var hyppigheden af positiv tumorfarvning for claudin 1 signifikant højere (39%) . En positiv sammenhæng blev også fundet med EGFR, en markør for dårlig prognose. Overraskende blev der også fundet en signifikant sammenhæng med claudin 1 og markører for den basallignende undertype af brystkræft , en aggressiv undertype af brystkræft forbundet med den værste prognose og reduceret patientoverlevelse. Vi demonstrerede også for første gang, at i den østrogenreceptorpositive (Erve) humane cellelinie, MCF7, at claudin 1-ekspression blev nedreguleret af østrogen in vitro (upublicerede data).

6. Er Claudin 1 Meget mere end en Tumorundertrykker i Brysttumorigenese?

både en over-og en underekspression af claudin 1 er blevet observeret i forskellige typer kræftformer , der skitserer kompleksiteten af dens potentielle rolle i carcinogenese. I brystkræft, de fleste undersøgelser, der er offentliggjort til dato, selvom de er begrænsede i antal, viser, at delvis eller totalt tab af claudin 1-ekspression korrelerer med øget malignt potentiale og invasivitet og med gentagelse af sygdom . Såvel, genudtrykket af claudin 1 i brystkræftceller blev påvist at inducere apoptose . Derudover viste vores vævsmikroarray-undersøgelser, at en signifikant lav frekvens af humane invasive brystkræft var positiv for claudin 1-ekspression . Alt i alt giver disse undersøgelser dokumentation for, at claudin 1 fungerer som en tumorundertrykker i brysttumorigenese.

paradoksalt nok har vores laboratorium også fremlagt bevis for, at claudin 1 ‘ s rolle i brystkræft kan være meget mere end en tumorundertrykkende. Vi viste i vores TMA-undersøgelser, at hyppigheden af claudin 1-positive tumorer var signifikant højere i Erve-brystkræft end i ERve-brystkræft . Så vidt vi ved, er disse undersøgelser den første rapport, der behandler claudin 1-udtryk i brystkræft i forbindelse med ER-status. Vi viste endvidere, at claudin 1-positivitet (såvel som claudin 4) var signifikant forbundet med den basallignende undertype af brystkræft, en af de mest aggressive undertyper . Bemærk, i en nylig undersøgelse foretaget af Kulka et al., 2008 blev det påvist, at claudin 4-ekspression var signifikant højere i den basallignende undertype af brystkræft . Da claudin 1 generelt anses for at være en” tumorundertrykker ” i brystkræft, var vores observationer uventede. Hvordan kan sådanne observationer rationaliseres? Der er et par mulige scenarier, der kan forklare disse resultater. For det første er det plausibelt, at ikke alle tumorceller under tumorigenese mister claudin 1-ekspression. I tråd med den foreslåede ikke-lineære model af brystkræftundertyper er det muligt , at cellerne, der bevarer claudin 1-ekspression, er cellerne, der allerede er forudbestemt til at blive Erve basallignende brystkræft. Derefter kan claudin 1 ‘ s rolle i disse celler være en tumorpromotor snarere end en tumorundertrykker. På den anden side, hvis man overvejer den lineære model af brystkræftundertyper , antages tumorceller at udvikle sig fra ERve til ERve, når kræften skrider frem. Derefter tilskrives den øgede hyppighed af claudin 1-positive tumorer i ERve-kohorten en genekspression af claudin 1 i disse tumorer? Et sådant koncept understøttes af den signifikant højere ekspression af claudin 1-farvning (en indikator for proteinekspression), der blev observeret i ERve-tumorer. Her elimineres tumorundertrykkelsesfunktionen af den genudtrykte claudin 1 således og erstattes nu af en tumorforstærkende funktion, hvorved brysttumorigenese Letter. Denne genekspression af claudin 1 kunne tilskrives en række formildende faktorer, herunder genetisk mutation i claudin 1-genet eller epigenetisk modifikation af proteinet. Imidlertid, sekvensanalysestudier af det kodende område af claudin 1 hos både sporadiske og arvelige brystpatienter kunne ikke identificere nogen signifikant mutation, der kan være ansvarlig for at ændre claudin 1-genekspression i brysttumorer. En interessant mulighed er, at det højere niveau af claudin 1-proteinet kan skyldes en defekt interagerende partner, hvilket resulterer i, at claudin 1 ikke kan transporteres tilbage til membranen, hvor det kan undslippe yderligere regulering af andre faktorer, og derfor fører til en ophobning af claudin 1 i cytoplasmaet. Sidstnævnte er for nylig blevet demonstreret for E cadherin . Desuden menes den nøjagtige kombination af claudinproteiner i et givet væv at bestemme styrken af det stramme kryds . Således kan en af konsekvenserne af denne afvigende ophobning af claudin 1 i ERve invasive brystkræft være en omdefinering af sammensætningen af det stramme kryds, hvilket yderligere underminerer integriteten af krydset og derved yderligere letter tumorprogression. Samlet set ser det ud til, at claudin 1 ‘ s rolle strækker sig ud over en tumorundertrykkende rolle. Vi vil gerne foreslå, at claudin 1 fungerer både som en tumorundertrykker såvel som en tumorforstærker/facilitator i brystkræft. Vi foreslår endvidere, at dens tumorfremmende rolle især er forbundet med Erve-brystkræftundertyperne (figur 3).

figur 3

en hypotetisk model af claudin 1 udtryk i forskellige brystkræftundertyper. Denne model foreslår, at claudin 1 er en tumorsuppressor i er+ve-undertyperne af brystkræft (luminal A og B) og en tumorforstærker/facilitator i er-Larrus-undertyperne (basallignende, HER2 over udtryk, normal-lignende). Mens der er påvist en signifikant sammenhæng mellem claudin 1 og den basallignende undertype, er dette endnu ikke bestemt for Her2-overekspressionen og de normallignende undertyper.

for nylig er der identificeret en” claudin lav ” undertype af brystkræft, der primært var ERve og udviste lavt udtryk for claudin 3, 4 og 7 . Vi vil endvidere gerne foreslå en” claudin high ” subtype, der er ER–ve, og som udviser et højt udtryk for claudin 1 protein (og claudin 4). Denne undertype vil omfatte de basale – lignende brystkræft og udelukke ERve luminale undertyper. Den kliniske betydning af et højt ekspression af claudin 1-proteinet i ERve brystkræft og dets tilknytning til den basallignende undertype kan identificere dets potentielle anvendelse som en diagnostisk og prognostisk indikator for en bestemt brystkræftundersæt.

7. Fremtidsperspektiver

montering tyder på, at claudin 1 har en unik rolle i brystkræft og brystkræft progression. Da claudin 1 er et transmembranprotein med to store ekstracellulære sløjfer, er det en potentielt attraktiv kandidat til brug i terapeutiske strategier. Når vi begynder at tage fat på rollen som claudin 1 i brystkræftprogression, står vi tilbage med mange ubesvarede spørgsmål. Hvad er ekspressionsniveauet for claudin 1-proteinet i forskellige histologiske undertyper af brystkræft? Hvad udløser dens regulering og får claudin 1 til at skifte sin rolle på forskellige stadier af brystkræftprogression? Hvorfor ophobes claudin 1 i cytoplasmaet? Er der en mutation i claudin-genet eller proteinet i den basale-lignende undertype af brystkræft? Arbejder claudin 1 sammen med andre claudiner eller junctionelle proteiner som E cadherin? Er der kryds tale med østrogenreceptorvejen? Det er klart, at mere detaljerede funktionelle analysestudier er berettigede både in vitro og in vivo.

man kan kun forudsige, at flere brystkræftundertyper vil blive identificeret i den nærmeste fremtid, og en klarere forståelse af de cellulære og molekylære ændringer, der opstår under brysttumorigenese, vil være kritisk for at lette mere effektiv patienthåndtering og direkte påvirke reduktion af dødeligheden. Kun gennem en sådan forståelse identificeres nye biomarkører, der vil rapportere om metastatiske ændringer, brystkræftprogression og tjene som terapeutiske mål, der i sidste ende fører til specifik og individualiseret patientstyring.

anerkendelse

forfatterne anerkender taknemmeligt finansiering til dette arbejde, der blev leveret af Manitoba Medical Services Foundation, Paul Thorlakson Foundation og Canadian Breast Cancer Foundation.