US Food, Drug and Cosmetic Act of 1938 krævede, at producenter og lægemiddelvirksomheder var ansvarlige for sikkerheden af lægemiddeladditiver / hjælpestoffer i deres produkter som reaktion på en tragedie, hvor 100 børn blev dræbt af tilstedeværelsen af diethylenglycol i et antibakterielt produkt. For at hjælpe med at afklare, hvad der er nødvendigt for at etablere et nyt hjælpestof, udgav FDA i 2005 et vejledningsdokument med titlen ‘ikke-kliniske undersøgelser til sikkerhedsevaluering af farmaceutiske hjælpestoffer’, der skitserede de sikkerhedsundersøgelser, der var nødvendige for at få et hjælpestof godkendt1, 2. Nylige artikler har opfordret til behovet for flere alternative hjælpestoffer til brug i formuleringer1,3,4. Formulatorer foretrækker generelt præcedente hjælpestoffer på grund af deres veletablerede sikkerhedsprofil samt de risici og omkostninger, der er forbundet med godkendelse af et nyt hjælpestoff3. Ved kvalificering af et nyt hjælpestof skal der udføres sikkerhedsundersøgelser, og i tilfælde af en bivirkning er der tvivl om, hvorvidt bivirkningen skyldtes hjælpestoffet eller produktet. Når du bruger et hjælpestof, mens tidligere erfaring med enhver injicerbar indgivelsesvej er værdifuld i begrundelsen for dets anvendelse, det er værd at bemærke,at under gældende regler kan ændring af indgivelsesvejen eller forøgelse af koncentrationen ud over dens nuværende højeste dosis kræve yderligere sikkerhedsdata1, 2. Behovet for nye hjælpestoffer er velkendt, men det er lige så vigtigt at udvide vores viden om brugen af mindre udbredte hjælpestoffer, samtidig med at det giver en lettere lovgivningsmæssig vej fremad.
bestemmelse af det korrekte pH-og buffersystem er uden tvivl det mest kritiske trin i formuleringen af et protein for at sikre dets opløselighed og stabilitet (kemisk og fysisk)3,5-7. Artiklen vil fokusere på stabilisering af bioterapeutika. Buffere, der findes i både små molekyler og proteinparenterale formuleringer godkendt af FDA, vil blive henvist til som begrundelse for at undersøge de stabiliserende virkninger af disse buffere på proteiner. Tabel 1 viser antallet af unikke formuleringer, der findes i etiketterne på produkter, der er godkendt af FDA. Identiske formuleringer som følge af formuleringen af generiske lægemidler eller forskellige doseringsstyrker blev udelukket. Når der henvises til saltformen af bufferen, skal bufferen antages at være titreret med natriumhydroksid eller saltsyre, da disse er de mest almindelige titranter.
de mest almindelige buffere, der blev fundet anvendt i parenterale formuleringer, har været citrat, phosphat og acetat. Nogle af de styrker og svagheder, der er forbundet med disse hjælpestoffer, vil blive fremhævet. Målet med dette papir er at henlede opmærksomheden på andre godkendte, men mindre almindeligt anvendte buffermidler, der kræver mere omfattende brug for at blive almindeligt accepteret. Mens denne artikel udelukkende vil fokusere på buffere, strækker det samme argument sig til andre typer hjælpestoffer. Efterhånden som bioteknologien udvikler sig som en industri, og der udvikles mere unikke proteinstilladser, bliver det stadig vigtigere at finde nye måder at stabilisere disse proteiner på. Nogle gange vil de mest almindelige hjælpestoffer ikke være tilstrækkelige til at give tilstrækkelig stabilitet eller muliggøre lægemiddelleveringsteknologier.
brancheeksperter fra AbbVie, Vectura og Bayer diskuterer bedste praksis og deres erfaringer med digital transformation i vores seneste rundbordsmøde
Se Vores en-times session om ‘Afdæk potentialet i dit laboratorium – opdag, hvordan digital transformation kan være så meget mere end bare indsigt’, hvor vores panel undersøger, hvordan digital transformation kan hjælpe med at fremskynde beslutningstagning, optimere processer og fjerne operationel ineffektivitet. Du vil få en forståelse af, hvordan implementering af en datastyringsløsning har hjulpet organisationer med at implementere nye metoder og transformere arbejdsgangsprocesser
se nu
almindeligt anvendte buffere
natriumphosphat
natriumphosphat (pKa 2.1, 7.2 og 12.3) er den mest almindeligt anvendte buffer, der findes i parenterale formuleringer (tabel 1). Den mest bemærkelsesværdige begrænsning ved anvendelse af fosfat som buffer er virkningen af frysning på ændringer i pH. skiftet i pH under frysning er blevet undersøgt grundigt. PH-skiftet tilskrives den selektive krystallisation af det dibasiske salt. Krystallisation kan påvirkes af frysehastigheden, start-pH og tilstedeværelsen af andre cosolutter. Et skift i pH på ca.to enheder er ret typisk under frysning, men skift i pH op til 3,6 enheder er blevet rapporteret8-10. Det ændrede pH-miljø har potentiale til at destabilisere protein under behandling af lægemiddelstof i bulk eller lyofilisering af lægemiddelopløsninger11-17. Dette er mest bekymrende under forhold, hvor der anvendes høje fosfatkoncentrationer, eller andre krystalliserende hjælpestoffer er til stede, da disse betingelser hjælper med at inducere fosfatkrystallisation. Opløsninger indeholdende høje koncentrationer af protein eller ikke-krystalliserbare opløste stoffer (f.eks. saccharose) vil hæmme fosfatkrystallisation og minimere ph-forskydninger.
citronsyre
citronsyre er en af de mest anvendte buffere (tabel 1). Det er en trivalent buffer, der indeholder tre carboksyl syrer med pKa på 3,1, 4,8 og 6,4 (tabel 2), der tilbyder et bredt bufferinterval5. Ifølge FDA ‘ s inaktive ingrediens Database findes citrat i over 100 godkendte injicerbare produkter, hvilket giver det en stor brugshistorie og beviser dets sikkerhed.
undersøgelser, der sammenligner subkutane injektioner af citratbufrede formuleringer mod lignelige formuleringer bufret med phosphat eller histidin, har imidlertid fastslået, at citratbufferede opløsninger inducerede mere smerte ved subkutan injektion18-20. Mens denne smerte var relativt kort i varighed (mindre end to minutter), giver det anledning til bekymring for patientens overholdelse af selvadministrerende injektioner indeholdende citrat18. Ved formulering med citronsyre skal målproduktprofilen og den tilsigtede indgivelsesvej noteres. Når hyppige subkutane injektioner er beregnet, kan et andet buffermiddel være mere passende.
eddikesyre
eddikesyre har en pKa på omkring 4,8 og tilbyder et bufferinterval på 3,7-5,6 (tabel 2). Anvendelsen af eddikesyre er ideel til formulering af proteiner, der er stabile i flydende tilstand under sure betingelser. Lyofiliseringen af eddikesyreopløsninger ledsages af en stigning i pH på grund af sublimeringen af bufferens Flygtige syreform, hvilket efterlader basissaltet. Dette er potentielt destabiliserende for proteinet og gør det vanskeligt at kontrollere pH i de frysetørrede lægemidler.
yderligere godkendte buffere
tromethamin
tromethamin (Tris) (pKa 8.1) har lignende egenskaber som phosphat (pKa 7.2) og kunne bruges som erstatning nær neutrale pH-forhold. Begge buffere udviser en pH-ændring under frysning. Under identiske betingelser var pH-skiftet for tromethamin (+2,1) omtrent lig med fosfat ( 1,8), men i modsat retning (tabel 2)8.
valg af en buffer frem for en anden ville så sandsynligvis være afhængig af følsomheden af det enkelte protein til retningen af pH-skiftet og eventuelle specifikke protein-bufferinteraktioner. Tromethamin og histidin har vist sig at være bedre stabilisatorer end phosphat, når erythropoietin blev udsat for høj temperaturspænding, hvilket forhindrer aggregering ved at hjælpe reversibiliteten af unfolding21. Ure2p viste sig at være mere stabil mod fibrildannelse, når den blev formuleret i tromethamin versus phosphat22.
histidin
histidin, en essentiel aminosyre, bliver stadig mere almindelig i formuleringer af proteinterapeutika. Med en pKa på 6,1 er den ideel til proteinformuleringerne nær neutrale betingelser (tabel 2).
histidin har vist sig at beskytte et monoklonalt antistof i både flydende og lyofiliseret tilstand mod varmestress23-25. Undersøgelser, der undersøgte stabiliteten af interferon-tau, viste, at formuleringer indeholdende histidin (efterfulgt af Tris derefter phosphat) var de mest stabile over for varmeinduceret aggregering. Denne stabilisering blev tilskrevet direkte binding af histidin til proteinet26. Under lyofilisering har histidin og asparaginsyre vist sig at beskytte antistoffer ved at fungere som en hydrogenbindingsdonor for at bevare intramolekylære karrusark24-25. Derudover har histidin vist sig at have egenskaberne af et antioksidant på grund af dets evne til at binde jernioner og singlet ilt24,27. Ulempen ved at bruge histidin er, at histidinopløsninger er blevet observeret at ændre farve under accelererede temperaturer og sur pH samt ekstrahere jern fra rustfrit stål24.
gluconsyre, mælkesyre og vinsyre
gluconsyre, mælkesyre og vinsyre er hjælpestoffer, der næsten udelukkende er blevet anvendt i små molekylformuleringer. Calciumgluconat er blevet licenseret til behandling af hydrogenfluoridforbrændinger gennem en topisk applikation. I mere alvorlige tilfælde er en infusion af en fire procent calciumgluconatopløsning i saltvand blevet anvendt til forebyggelse af vævsskader28. Ud af de 23 kommercielt tilgængelige, injicerbare formuleringer indeholdende mælkesyre, der findes i FDA – databasen med inaktive ingredienser, anvendes fire formuleringer til biologiske stoffer-to peptider og to proteiner. Af de 12 formuleringer, der indeholder vinsyre, er kun en blevet anvendt til formulering af et protein. Disse buffere kan være egnede erstatninger for acetat og citrat.
gluconsyre er en forbindelse, der er naturligt dannet af glucoseoksidering. Det er en interessant forbindelse, da den har potentialet til at fungere som en buffer, stabilisator og chelateringsmiddel på grund af det, der har en struktur indeholdende carboksyl syrer og hydroksyl grupper.
Tartarat har vist sig at forbedre retentionen af monomer over citrat i en antistofformulering ved pH 4,0-4,5, når den opbevares som en væske ved 25 liter C29. Det er blevet antaget, at hydroksylgrupperne i tartarat, citrat, malat og i forlængelse heraf lactat og gluconat kunne levere stabiliserende hydrogenbindinger i den amorfe fase af en frysetørret kage30-31.
asparaginsyre og glutaminsyre
både asparaginsyre og glutaminsyre findes i infusioner givet til spædbørn og pædiatriske patienter med utilstrækkelige plasmakoncentrationer af aminosyrer. I Trofaminkrus infunderes aspartat og glutamat i koncentrationer på henholdsvis 22 mM og 34 mm32. Disse koncentrationer er tilstrækkeligt høje til at tilvejebringe tilstrækkelig buffering af proteinformuleringer.
glutaminsyre,når den er formuleret med lige store mængder arginin,har vist sig at forbedre stabiliteten og opløseligheden af intracellulære proteiner23, 33 samt forhindre aggregering under rekonstitution23, 34-35. Undersøgelser af insulin og humant serumalbumin indikerer, at tilsætningen af glutamat og aspartat var i stand til at hæmme dannelsen af aggregater36-38. Undersøgelser med pegfilgrastim viste, at stabiliteten af pegfilgrastim formuleret i glutamat eller formiat var sammenlignelig med acetat39.
mellemprodukter med citronsyrecyklus
Citrat, fumarat, Kurt-ketoglutarat, malat og succinat er alle mellemprodukter i citronsyrecyklussen, der viser sig at være sikre og effektive som buffere eller modioner i injicerbare formuleringer. Fumarat, Kurt-ketoglutarat, malat og succinat er blevet anvendt i et begrænset antal produkter (tabel 1). Det er indlysende, at de andre mellemprodukter i Krebs-cyklussen også kan være egnede til brug i parenteraler. Disse forbindelser omfatter aconitat, isocitrat og oksaloacetat. Da de er divalente og trivalente, har de pKa ‘ er fra 2,0 til 6,4, hvilket gør disse forbindelser egnede til en lang række formuleringer (tabel 2).
på grund af den begrænsede anvendelse af disse forbindelser som buffere er det uklart, om den samme smerte ved injektion forbundet med subkutane injektioner af citrat ville være forbundet med disse forbindelser. Der er dog andre fordele forbundet med deres anvendelse. Citrat har vist sig at inducere gelering af antistofopløsninger, når proteinkoncentrationen var over 100 mg/mL. Dette blev tilskrevet bufferens trivalente karakter. Succinat, der kun havde to carboksyl syrer, viste sig ikke at have samme virkning ved samme pH40.
konklusion
bestemmelse af det korrekte pH-og buffersystem er afgørende for at bringe bioterapeutik ind i klinikken og på markedet. Behovet for nye hjælpestoffer samt en bedre forståelse af eksisterende hjælpestoffer er meget ønskeligt. Histidin, tromethamin og en række andre alternative buffere tilbyder fordele i forhold til konventionelt anvendte hjælpestoffer. Brugen af disse alternative buffere kan ikke gøre andet end at hjælpe med at udvide de værktøjer, formulatorer har, og kan muliggøre udvikling af et terapeutisk middel, der ellers kan have mislykkedes. For at stabilisere det store antal proteinterapeutika under udvikling bør alle tilgange være åbne for overvejelse.
1. Osterberg, R. E., Demerlis, C. C., Hobson, D. V., Mcgovern, T. J. (2011) tendenser i hjælpestof sikkerhedsevaluering. Int. J. Toks. 30, 600-610
2. FDA (2005) vejledning til industrien: ikke-kliniske undersøgelser til sikkerhedsevaluering af farmaceutiske hjælpestoffer
5. Stoll, V. S., Blanchard, J. S. (1990) buffere: principper og praksis. Metoder i Ensymologi. 182, 24-38
6. Trevino, S. R., J. M., Pace, C. N. (2008) måling og øget Proteinopløselighed. J. Pharm. Sci. 97, 4155-4166
7. (2010) Proteinaggregering-veje og påvirkningsfaktorer. Int. J. Farmaceutik. 390, 89–99
8. John Smith, D. (1977) Changes in Apparent pH on Freezing Aqueous Buffer Solutions and their Relevance to Biochemical Electron-Paramagnetic-Resonance Spectroscopy. Biochem. J. 167, 593-600.
27. Wade, A. M., Tucker, H.N. (1998) Antioxidant Characteristics of L-Histidine. J. Nutr. Biochem. 9, 308-315
32. B. Braun Medical Inc. TROPHAMINE – isoleucine, leucine, lysine acetate, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, valine, cysteine hydrochloride, histidine, tyrosine, n-acetyl-tyrosine, alanine, arginine, proline, serine, glycine, aspartic acid, glutamic acid and taurine solution
34. Zhang M.Z., Wen J., Arakawa T., Prestrelski S.J. (1995) A New Strategy for Enhancing the Stability of Lyophilized Protein: The Effect of the Reconstitution Medium on Keratinocyte Growth Factor. Pharmacol. Res. 12, 1447–1452
36. Quinn, R., Andrade, J. D. (1983) minimering af aggregeringen af neutrale Insulinopløsninger. J. Pharm. Sci. 72, 1472-1473
39. Piedmonte, D. M., Treuheit, M. J. (2008) formulering af Neulasta (pegfilgrastim). Adv. Drug Delivery Anmeldelser. 60, 50–58
41. Sundaramurthi, P., Suryanarayanan, R., (2011) forudsiger Krystallisationstilbøjeligheden af Carboksyl Syrebuffere i frosne systemer—relevans for frysetørring. J. Pharm. Sci. 100, 1288–1293
42. Sundaramurthi, P., Suryanarayanan, R., (2011) termofysiske egenskaber af Carboksyliske og Aminosyrebuffere ved temperaturer under nul: Relevans for frosset Tilstandsstabilisering. J. Phys. Chem. B. 115, 7154-7164
om forfatteren
David Sek tjente sin BS i kemi fra Bates College og hans MS i Kemi og kemisk biologi fra Northeastern University. Han har 10 års erfaring som formuleringsforsker og har brugt de sidste otte år på at studere stabiliteten af nye bioterapeutika.