Claudin 1 v prsu Tumorigenesis: odhalení možného románu“ Claudin High “ podmnožina rakoviny prsu

Abstrakt

Claudiny jsou hlavní složkou těsných spojů v epiteliálních buňkách a jako takové hrají klíčovou roli v polarizovaném umístění iontových kanálů, receptorů a enzymů do různých membránových domén. V tomto ohledu jsou claudiny nezbytné pro harmonický vývoj funkčního epitelu. Kromě toho byly vadné těsné spoje spojeny s vývojem neoplastického fenotypu v epiteliálních buňkách. Rozpad interakcí mezi buňkami a deregulace exprese junkčních proteinů se proto považuje za klíčové kroky při invazi a metastázách. Několik studií naznačuje, že claudiny jsou hlavními účastníky tumorigeneze prsu. V tomto článku, diskutujeme o nedávných pokrocích v našem chápání potenciální role claudinu 1 v rakovině prsu. Diskutujeme také význam podmnožiny negativních rakovin prsu estrogenového receptoru, které exprimují „vysoké“ hladiny proteinu claudin 1. Navrhujeme, aby claudin 1 fungoval jak jako supresor nádoru, tak jako nádorový zesilovač/facilitátor u rakoviny prsu.

1. Rakovina prsu

rakovina prsu zůstává jednou z nejčastěji diagnostikovaných rakovin u žen v Severní Americe . Na základě molekulárních, epidemiologických a histologických pozorování byl v posledním desetiletí sestaven model morfologické progrese rakoviny prsu . Tento navrhovaný model (Obrázek 1) popisuje kontinuum lézí popisujících postupnou progresi rakoviny prsu, od epiteliální hyperplazie, přes atypickou hyperplazii a duktální karcinom in situ, k invazivnímu karcinomu a nakonec metastazujícímu onemocnění . Navzdory mnoha pokrokům v diagnostice a léčbě rakoviny prsu zůstává metastáza nepřekonatelnou výzvou. Asi 40% žen v současné době selhává v primárních strategiích řízení pro časnou rakovinu prsu a nakonec podlehne nemoci.

Obrázek 1

hypotetický model tumorigeneze a progrese prsu. Postupná progrese rakoviny prsu je popsána jako kontinuum lézí od epiteliální hyperplazie po invazivní karcinom a případně metastázy.

složitá povaha prezentace onemocnění a omezení při identifikaci klinicky relevantních podskupin pacientů vytvářejí velké potíže pro současné diagnostické a terapeutické strategie rakoviny prsu. Rostoucí chápání heterogenní povahy tohoto onemocnění pramenilo především z mikroarray cDNA a imunohistochemických studií, které vedly k redefinici podmnožin rakoviny prsu . K dnešnímu dni bylo identifikováno 5 odlišných kategorií rakoviny prsu (Tabulka 1, ) na základě stavu ER/PR, Her2, CK5/6 a exprese EGFR. Terapeuticky se ukázalo, že tyto podtypy vykazují širokou škálu odpovědí na různé léčby . Luminální podtyp A (tabulka 1), který je citlivější na hormony, má nejpříznivější výsledek, zatímco Her2 a bazální podtypy, které nejsou citlivé na hormony, jsou agresivnější, vykazují nejhorší prognózu a mají méně terapeutických možností . Je zřejmé, že další identifikace různých podtypů rakoviny prsu poskytne více terapeutických příležitostí, aby odpovídaly charakteristikám jednotlivých pacientů s rakovinou prsu, což zvyšuje naši schopnost začít pacientům nabízet individualizovanou léčbu.

byly navrženy dva hypotetické modely, které vysvětlují vývoj podtypů rakoviny prsu . V prvním modelu, lineárním modelu, je buňka původu stejná pro různé podtypy nádorů (a tak je podtyp nádoru určen získanými genetickými a epigenetickými událostmi). Ve druhém modelu, nelineárním modelu, je buňka původu odlišná (pravděpodobně kmenová buňka nebo progenitorová buňka) pro různé podtypy. Nedávná práce Jeselsohna a kol. poskytl důkazy, které naznačují, že existují dvě populace progenitorových buněk, z nichž jedna vede k luminálním karcinomům prsu a druhá k bazálním karcinomům prsu.

2. Epiteliální mezenchymální přechod (EMT)

předpokládá se, že získání invazivního fenotypu znamená nejvýznamnější změnu v biologii rakoviny prsu, protože představuje první krok k rozvoji metastatického onemocnění. Jak se buňky převádějí z neinvazivního na invazivní fenotyp, stávají se nezávislými na ukotvení a vykazují zvýšenou motilitu a zvýšenou agresivitu, což je proces označovaný jako epiteliální-mezenchymální přechod (EMT).

během tohoto přechodu získávají epiteliální buňky mezenchymálně podobný fenotyp narušením mezibuněčné adheze a zvýšenou motilitou (přehled viz). Předpokládá se, že buňky přecházejí z keratinové (epiteliální) bohaté sítě na vimentinovou (mezenchymální) bohatou síť, aby se usnadnila jejich pohyblivost . Pokud jde o mezenchymální buňky, na rozdíl od epiteliálních buněk mohou individuálně migrovat, pronikat do okolních tkání a šířit se do vzdálených míst . Rozklad interakcí buňka-buňka a deregulovaná exprese junkčních proteinů jsou proto považovány za klíčové kroky v invazi a metastázách .

3. Těsné křižovatky

těsné křižovatky jsou nejvíce apikální mezibuněčných křižovatek a objevují se jako síť spojitých a anastomózních vláken na protoplazmatické ploše plazmatické membrány (Obrázek 2). Přispívají k transepiteliální bariéře, která řídí transport iontů a malých molekul paracelulární cestou, což je vlastnost označovaná jako „bariérová“ funkce . Těsné spoje jsou také zásadní pro organizaci polarity epiteliálních buněk, oddělující plazmatickou membránu do apikálních a bazolaterálních domén . Také, jsou také kritické pro polarizované umístění iontových kanálů, receptory, a enzymy k membránovým doménám nezbytným pro strukturálně a funkčně vyvinutý epitel, funkce označovaná jako funkce“ plotu“. Těsné spoje jsou proto nezbytné pro těsné utěsnění buněčných plechů a udržení homeostázy . Kromě udržování polarity buněk a paracelulárních funkcí se těsné spojovací proteiny podílejí na náboru signálních proteinů . Primárně, tři typy integrálních membránových proteinů tvoří těsné spojení (Obrázek 2); claudiny, okludin a spojovací adhezní molekula(molekuly), přičemž claudiny a okludin jsou dvě hlavní molekulární složky při vytváření těsného spojovacího řetězce. Předpokládá se, že spojovací adhezní molekula funguje jako počáteční prostorová narážka pro tvorbu těsných spojů . Ve spojení s adherenními spojovacími proteiny, které jsou zodpovědné za mechanickou adhezi mezi sousedními buňkami a stabilizaci celé mnohobuněčné architektury, tvoří apikální spojovací komplex v epiteliální tkáni .

Obrázek 2

Úzké Křižovatky. Těsné křižovatky jsou nejvíce apikální mezibuněčné křižovatky v epiteliálních buňkách. Hlavními molekulárními složkami těsných spojů jsou claudiny, okludin a spojovací adhezní molekula (JAM). Pevné spojovací proteiny ve spojení s adherenovými spojovacími proteiny (kadheriny, kateniny) tvoří spojovací komplexy epiteliálních buněk . Mezera křižovatka je umístěna bazálně na adheren křižovatce.

4. Pevné spojovací proteiny a Tumorigeneze

byla zjištěna silná souvislost mezi těsnými spojovacími proteiny a vývojem rakoviny. Změny ve struktuře a funkci těsných spojů byly skutečně hlášeny u adenokarcinomů různých orgánů . Absence těsných spojů nebo defektních těsných spojů byla také spojena s vývojem neoplastického fenotypu v epiteliálních buňkách . Taková pozorování jsou v souladu s přijatou myšlenkou, že narušení těsných spojů vede ke ztrátě soudržnosti, invazivity a nedostatku diferenciace, čímž podporuje tumorigenezi. V současné době většina znalostí o úloze junkčních proteinů v rakovině a konkrétněji rakoviny prsu pramenila ze studií o hlavním adheren junction proteinu, e cadherinu (pro přehled viz ). Downregulace e cadherinu je považována za důležitou molekulární událost během epiteliálně-mezenchymálního přechodu . Na rozdíl od E cadherinu není úloha těsných spojovacích proteinů u rakoviny prsu dobře známa.

4.1. Claudiny

claudiny jsou hlavní složkou těsného spojení a dosud bylo identifikováno 24 členů této rodiny proteinů . Jsou to malé proteiny o velikosti od 22 do 27 kD a jsou kódovány nejméně 17 lidskými geny (Tabulka 2), které se nacházejí na 12 různých chromozomech . Distribuce lokusů pro claudinovy geny mezi tolika různými chromozomy je zajímavá, protože obecně má mnoho genových rodin většinu, ne-li všichni jejich členové umístěni na jednom chromozomu . Široká distribuce může odrážet multifunkční vlastnosti těchto proteinů. Tři klastry klaudinových genů jsou snadno patrné na chromozomu 3 (3q28), 4 (4q35.1) a 7 (7q11.23) a je velmi pravděpodobné, že členové těchto klastrů mohou mít podobnou funkci a tkáňovou specificitu . Kromě těchto tří klastrů claudinových genů se zdá, že neexistuje žádný jiný zřejmý vzorec (Tabulka 2). Je možné, že rozšíření rodiny claudinových genů u lidí mohlo umožnit získání nových funkcí během evoluce, jak se předpokládá pro tuto genovou rodinu u teleost ryb . Klaudiny sdílejí společnou transmembránovou topologii; předpokládá se, že každý člen rodiny má čtyři transmembránové domény s intracelulárními amino a karboxyl-termini v cytoplazmě a dvě extracelulární smyčky . Vzorec exprese claudinových proteinů je tkáňově specifický ; většina tkání však exprimuje více klaudinů, které mohou interagovat buď homotypickým nebo heterotypickým způsobem, aby vytvořily těsný spojovací řetězec . Přesná kombinace klaudinových proteinů v dané tkáni určuje selektivitu, sílu a těsnost těsného spojení .

k dnešnímu dni se jen několik studií zabývalo úlohou claudinů v rakovině prsu a zjištění o jejich funkci zůstávají kontroverzní . U několika druhů rakoviny, včetně rakoviny prsu, byla prokázána změněná exprese proteinů některých členů rodiny claudinů(pro přehled viz). Například bylo prokázáno, že proteinová exprese claudinu 3 a 4 je upregulována u invazivního karcinomu prsu, zatímco také u invazivního karcinomu prsu byla exprese proteinů claudinu 1 a 7 snížena .

4.2. Claudin 1

Knockout myší experimenty prokázaly, že těsný spojovací protein claudin 1, a ne okludin, tvoří páteř těsného spojovacího řetězce a je rozhodující pro funkci epidermální bariéry . Exprese claudinu 1 byla zkoumána u řady rakovin (pro přehled viz). Bylo prokázáno, že zvýšení i snížení exprese proteinu claudin 1 je spojeno s tumorigenezí. U některých druhů rakoviny, včetně prostaty , prsu a melanocytární neoplazie , byla ztráta claudinu 1 spojena s progresí a invazí rakoviny a získáním metastatického fenotypu. U spinocelulárního karcinomu jícnu se snížila exprese claudinu 1 v korelaci s recidivou a kratším přežitím bez onemocnění, zatímco u rakoviny plic bylo prokázáno, že claudin 1 potlačuje expresi zesilovačů invaze / metastáz a zvyšuje expresi supresorů invaze/metastáz, čímž poskytuje podpůrné důkazy, které naznačují, že funguje jako nádorový invaze/metastáz supresor . Naopak u jiných rakovin, jako je papilární karcinom štítné žlázy , karcinom vaječníků , tlustého střeva , melanom a žaludek , byla nadměrná exprese claudinu 1 spojena s agresivitou a zvýšeným maligním fenotypem. Dále funkční studie ukázaly, že claudin 1 by mohl rekrutovat a podporovat aktivaci metaloproteinázy MMP-2 a vést k agresivnějšímu fenotypu u rakoviny ústní a vaječníků.

5. Claudin 1 u normálního karcinomu prsu a prsu

v normální mléčné žláze byly proteiny těsného spojení zkoumány hlavně ve vztahu k laktogenezi . Předchozí práce z naší laboratoře identifikovala claudin 1 jako vysoce upregulovaný Gen během časné involuce mléčné žlázy, a bylo zjištěno, že jeho exprese je přísně regulována během různých fází normálního vývoje myší žlázy . V poslední době se zvýšil zájem o potenciální roli claudinu 1 u rakoviny prsu. Ačkoli studie jsou stále relativně omezené, existuje několik kritických zpráv, které prokazují jasnou souvislost mezi expresí claudinu 1 a progresí rakoviny prsu. Většina studií poukazuje na downregulaci nebo úplnou ztrátu exprese claudinu 1 u maligních invazivních lidských karcinomů prsu a u některých lidských buněčných linií rakoviny prsu. Nedávno byla také hlášena korelace mezi regulací dolů claudin 1 a recidivou onemocnění . Navíc funkční studie také naznačují, že claudin 1 může být klíčovým hráčem v nádorové nádorigenezi prsu. Ukázalo se, že down regulace exprese genu claudin 1 vede k neoplastické transformaci epiteliálních buněk prsu . Ukázalo se také, že reexprese samotného claudinu 1 je dostatečná k indukci apoptózy v buněčné linii lidského karcinomu prsu . Bylo také navrženo, že samotný claudin 1 může být dostatečný k tomu, aby v metastatických nádorových buňkách působil pevně zprostředkovaná funkce brány, a to i v nepřítomnosti jiných proteinů spojených s těsným spojením . Kromě toho bylo prokázáno, že subcelulární lokalizace claudinu 1 je (námi i ostatními ) narušena u invazivního karcinomu prsu, což vede k detekci tohoto proteinu v cytoplazmě. Zajímavé je, že nedávno byla stanovena souvislost mezi claudinem 1 a epiteliálním mezenchymálním přechodem. Stejně jako u e cadherinu bylo prokázáno, že transkripční faktory, slimák a hlemýžď, klíčové markery epiteliálního mezenchymálního přechodu, se vážou na promotor claudinu 1, což vede k potlačení jeho aktivace .

další práce z naší laboratoře také poskytla důkazy, které ukazují, že exprese claudinu 1 u rakoviny prsu je ještě složitější, než se původně myslelo. Pomocí strategií tkáňového mikroarray jsme ukázali, že v kohortě lidských invazivních karcinomů prsu vykazujících smíšené patologické léze (340 biopsií, největší dosud zkoumané), pouze malé procento nádorů exprimuje protein claudin 1. Frekvence pozitivních nádorů claudin 1 byla významně nižší než frekvence nádorů pozorovaných jako pozitivní pro claudin 3 a 4, U dvou členů rodiny se dříve ukázalo, že jsou nadměrně exprimováni u invazivního lidského karcinomu prsu .

vzhledem k tomu, že stav ER je často považován za důležitý klasifikátor rakoviny prsu (Tabulka 1), chtěli jsme zjistit, zda existuje nějaká souvislost mezi estrogenovým / estrogenovým receptorem a claudinem 1. Ukázali jsme, že u karcinomů prsu ERve (189 biopsií) byl významně malý počet nádorů (5%) pozitivní na expresi claudin 1, zatímco u nádorů ERve (151 biopsií) byla frekvence pozitivního nádorového barvení pro claudin 1 významně vyšší (39%). Pozitivní asociace byla také nalezena s EGFR, markerem špatné prognózy. Překvapivě byla také zjištěna významná korelace s claudinem 1 a markery bazálního podtypu rakoviny prsu, agresivním podtypem rakoviny prsu spojeným s nejhorší prognózou a sníženým přežitím pacienta. Poprvé jsme také prokázali, že v lidské buněčné linii pozitivní na estrogenový receptor (ERve), MCF7, byla exprese claudinu 1 regulována estrogenem in vitro (nepublikovaná data).

6. Je Claudin 1 mnohem více než tumor supresor v nádorové Tumorigenezi prsu?

u různých typů nádorových onemocnění byla pozorována nadměrná i nedostatečná exprese claudinu 1, což naznačuje složitost jeho potenciální úlohy v karcinogenezi. U rakoviny prsu, většina dosud publikovaných studií, i když omezený počet, ukazují, že částečná nebo úplná ztráta exprese claudinu 1 koreluje se zvýšeným maligním potenciálem a invazivitou as recidivou onemocnění . Rovněž bylo prokázáno, že reexprese claudinu 1 v buňkách karcinomu prsu indukuje apoptózu . Navíc naše tkáňové microarray studie ukázaly, že významně nízká frekvence lidských invazivních karcinomů prsu byla pozitivní pro expresi claudin 1 . Celkově tyto studie poskytují podpůrné důkazy, které naznačují, že claudin 1 funguje jako tumor supresor v nádorové tumorigenezi prsu.

paradoxně naše laboratoř také poskytla důkazy, které naznačují, že role claudinu 1 v rakovině prsu může být mnohem více než nádorový supresor. V našich studiích TMA jsme ukázali, že frekvence pozitivních nádorů claudin 1 byla významně vyšší u karcinomů prsu ERve než u karcinomů prsu ERve . Pokud je nám známo, tyto studie jsou první zprávou, která se zabývá expresí Claudina 1 u rakoviny prsu v souvislosti se stavem ER. Dále jsme ukázali, že pozitivita claudin 1 (stejně jako claudin 4) byla významně spojena s bazálním podtypem rakoviny prsu, jedním z nejagresivnějších podtypů . Za zmínku stojí nedávná studie Kulka et al., 2008, bylo prokázáno, že exprese claudinu 4 byla významně vyšší v bazálním podtypu rakoviny prsu . Protože claudin 1 je obecně považován za“ tumor supresor “ u rakoviny prsu, naše pozorování byla neočekávaná. Jak lze taková pozorování racionalizovat? Existuje několik možných scénářů, které mohou tato zjištění vysvětlit. Za prvé, je pravděpodobné, že během tumorigeneze ne všechny nádorové buňky ztratí expresi claudinu 1. V souladu s navrhovaným nelineárním modelem podtypů rakoviny prsu je možné, že buňky, které si zachovávají expresi claudinu 1, jsou buňky již předurčené k tomu, aby se staly Erve bazálními karcinomy prsu. V těchto buňkách pak může být úlohou claudinu 1 spíše promotor nádoru než supresor nádoru. Na druhou stranu, pokud vezmeme v úvahu lineární model podtypů rakoviny prsu, předpokládá se, že nádorové buňky postupují z ERve na ERve, jak postupuje rakovina. Je tedy zvýšená frekvence pozitivních nádorů claudin 1 v kohortě ERve připisována reexpresi claudinu 1 v těchto nádorech? Takový koncept je podporován významně vyšší expresí barvení claudinem 1 (indikátor exprese proteinu), který byl pozorován u nádorů ERve. Zde je tedy funkce potlačující nádor reexprimovaného claudinu 1 eliminována a nyní nahrazena funkcí zvyšující nádor, čímž usnadňuje tumorigenezi prsu. Tato reexprese claudinu 1 může být přičítána řadě zmírňujících faktorů, včetně genetické mutace v genu claudinu 1 nebo epigenetické modifikace proteinu. Studie sekvenční analýzy kódující oblasti claudinu 1 u sporadických i dědičných pacientek prsu však nedokázaly identifikovat žádnou významnou mutaci, která by mohla být zodpovědná za změnu exprese genu claudin 1 u nádorů prsu. Jednou zajímavou možností je, že vyšší hladina proteinu claudin 1 může být způsobena vadným interakčním partnerem, což vede k neschopnosti claudinu 1 transportovat zpět do membrány, kde může uniknout další regulaci jinými faktory, a proto vede k akumulaci claudinu 1 v cytoplazmě. Ten byl nedávno prokázán pro E cadherin . Dále se předpokládá, že přesná kombinace klaudinových proteinů v dané tkáni určuje sílu těsného spojení . Jedním z důsledků této aberantní akumulace claudinu 1 v invazivních karcinomech prsu ERve tedy může být redefinice make-upu těsného spojení, což dále podkopává integritu křižovatky a tím dále usnadňuje progresi nádoru. Dohromady se zdá, že role Claudina 1 přesahuje úlohu supresoru nádoru. Chtěli bychom navrhnout, aby claudin 1 fungoval jak jako supresor nádoru, tak jako nádorový zesilovač/facilitátor u rakoviny prsu. Dále navrhujeme, že jeho role usnadňující nádor je zvláště spojena s podtypy rakoviny prsu ERve (obrázek 3).

obrázek 3

hypotetický model exprese claudinu 1 v různých podtypech rakoviny prsu. Tento model navrhuje, že claudin 1 je tumor supresor v ER + ve podtypech karcinomu prsu (luminální A A B) a tumor enhancer / facilitátor v erâ’ve ‚ ve podtypech (bazální, Her2 nad exprimující, normální). Zatímco byla prokázána významná souvislost mezi claudinem 1 a bazálním podtypem, toto je ještě třeba určit pro Her2 nad expresí a normálními podtypy.

nedávno byl identifikován podtyp „claudin low“ rakoviny prsu, který byl primárně ERve a vykazoval nízkou expresi claudinu 3, 4 a 7 . Dále bychom chtěli navrhnout podtyp „claudin high“, který je ER – ve a který vykazuje vysokou expresi proteinu claudin 1 (a claudin 4). Tento podtyp by zahrnoval bazální rakoviny prsu a vyloučil by luminální podtypy ERve. Klinický význam vysoké exprese proteinu claudin 1 U karcinomů prsu ERve a jeho souvislost s bazálním podtypem může identifikovat jeho potenciální použití jako diagnostický a prognostický indikátor pro konkrétní podskupinu karcinomu prsu.

7. Budoucí perspektivy

montážní důkazy naznačují, že claudin 1 má jedinečnou roli v rakovině prsu a progresi rakoviny prsu. Protože claudin 1 je transmembránový protein se dvěma velkými extracelulárními smyčkami, je potenciálně atraktivním kandidátem pro použití v terapeutických strategiích. Když začneme řešit roli Claudina 1 v progresi rakoviny prsu, zbývá nám mnoho nezodpovězených otázek. Jaká je úroveň exprese proteinu claudin 1 v různých histologických podtypech rakoviny prsu? Co spouští jeho regulaci a způsobuje, že claudin 1 mění svou roli v různých stádiích progrese rakoviny prsu? Proč se claudin 1 hromadí v cytoplazmě? Existuje mutace v genu claudin nebo proteinu v bazálním podtypu rakoviny prsu? Funguje claudin 1 ve shodě s jinými claudiny nebo junctional proteiny, jako je e cadherin? Existuje křížová řeč s cestou estrogenového receptoru? Je zřejmé, že podrobnější studie funkční analýzy jsou oprávněné Jak in vitro, tak in vivo.

lze pouze předpovědět, že v blízké budoucnosti bude identifikováno více podtypů rakoviny prsu a jasnější pochopení buněčných a molekulárních změn vyskytujících se během tumorigeneze prsu bude rozhodující pro usnadnění účinnějšího řízení pacientů a přímý dopad na snížení úmrtnosti. Pouze prostřednictvím takového porozumění budou identifikovány nové biomarkery, které budou informovat o metastatických změnách, progresi rakoviny prsu a budou sloužit jako terapeutické cíle, které nakonec povedou ke specifickému a individualizovanému řízení pacientů.

poděkování

autoři vděčně uznávají financování této práce, kterou poskytla nadace Manitoba Medical Services Foundation, Paul Thorlakson Foundation a kanadská Nadace pro rakovinu prsu.