americký zákon o potravinách, léčivech a kosmetice z roku 1938 vyžadoval, aby výrobci a farmaceutické společnosti byli odpovědní za bezpečnost drogových přísad / pomocných látek ve svých výrobcích v reakci na tragédii, kdy bylo 100 dětí zabito přítomností diethylenglykolu v antibakteriálním produktu. Aby bylo možné objasnit, co je zapotřebí k vytvoření nové pomocné látky, vydal FDA v roce 2005 Pokyny s názvem „neklinické studie pro hodnocení bezpečnosti farmaceutických pomocných látek“, které nastiňují studie bezpečnosti potřebné k tomu, aby byla pomocná látka schválena1, 2. Nedávné články volaly po potřebě více alternativních pomocných látek pro použití ve vzorcích1, 3, 4. Formulátory obecně dávají přednost precedentním pomocným látkám kvůli jejich dobře zavedenému bezpečnostnímu profilu, jakož i rizikům a nákladům spojeným se schválením nové pomocné látky3. Při kvalifikaci nové pomocné látky je třeba provést studie bezpečnosti a v případě nežádoucího účinku existují pochybnosti o tom, zda byl nežádoucí účinek způsoben pomocnou látkou nebo přípravkem. Při použití pomocné látky, zatímco předchozí zkušenosti s jakýmkoli injekčním způsobem podání jsou cenné pro odůvodnění jejího použití, stojí za zmínku, že podle současných předpisů může změna způsobu podání nebo zvýšení koncentrace nad současnou nejvyšší dávku vyžadovat další bezpečnostní údaje1,2. Potřeba nových pomocných látek je dobře známa, ale rozšíření našich znalostí o používání méně široce používaných pomocných látek je stejně důležité a zároveň nabízí snadnější regulační cestu vpřed.
stanovení správného pH a pufrového systému je pravděpodobně nejkritičtějším krokem při formulaci proteinu k zajištění jeho rozpustnosti a stability (chemické a fyzikální)3,5-7. Článek se zaměří na stabilizaci bioterapeutik. Pufry nalezené v malých molekulách a proteinových parenterálních formulacích schválených FDA budou odkazovány jako zdůvodnění pro zkoumání stabilizačních účinků těchto pufrů na proteiny. Tabulka 1 uvádí počet jedinečných formulací nalezených na štítcích produktů schválených FDA. Byly vyloučeny identické lékové formy vyplývající z formulace generických přípravků nebo různých dávkových sil. Kdykoli je zmíněna solná forma pufru, předpokládá se, že pufr bude titrován hydroxidem sodným nebo kyselinou chlorovodíkovou, protože se jedná o nejběžnější titranty.
nejběžnějšími pufry, které byly použity v parenterálních formulacích, byly citrát, fosfát a acetát. Budou zdůrazněny některé silné a slabé stránky spojené s těmito pomocnými látkami. Cílem tohoto příspěvku je upozornit na další schválené, ale méně běžně používané vyrovnávací paměti, které vyžadují rozsáhlejší použití, aby se staly obecně přijímanými. Zatímco tento článek se zaměří výhradně na pufry, stejný argument se vztahuje i na jiné typy pomocných látek. Jak se biotechnologie vyvíjí jako průmysl a vyvíjejí se více jedinečných proteinových lešení, bude stále důležitější najít nové způsoby stabilizace těchto proteinů. Někdy nejběžnější pomocné látky nebudou dostatečné k zajištění dostatečné stability nebo umožnění technologií dodávání léků.
odborníci z oboru AbbVie, Vectura a Bayer diskutují o osvědčených postupech a zkušenostech s digitální transformací v našem posledním kulatém stole
podívejte se na naši hodinovou relaci „Odhalte potenciál vaší laboratoře-objevte, jak digitální transformace může být mnohem víc než jen postřehy“, kde náš panel zkoumá, jak digitální transformace může pomoci urychlit rozhodování, optimalizovat procesy a odstranit provozní neefektivity. Získáte pochopení toho, jak nasazení řešení pro správu dat pomohlo organizacím implementovat nové metodiky a transformovat procesy workflow
WATCH NOW
běžně používané pufry
fosforečnan sodný
fosforečnan sodný (pKa 2.1, 7.2 a 12.3) je nejčastěji používaným pufrem nalezeným v parenterálních lékových formách (Tabulka 1). Nejvýznamnějším omezením při použití fosfátu jako pufru je účinek zmrazení na změny pH. posun pH během zmrazení byl rozsáhle studován. Posun pH je přičítán selektivní krystalizaci dibázické soli. Krystalizace může být ovlivněna rychlostí zmrazení, počátečním pH a přítomností dalších kosolutů. Během zmrazení je poměrně typický posun pH přibližně o dvě jednotky, ale byly hlášeny posuny pH až o 3,6 jednotky8-10. Měnící se prostředí pH má potenciál destabilizovat bílkoviny během zpracování sypké léčivé látky nebo lyofilizace roztoků léčivého přípravku11-17. To se nejvíce týká podmínek, kdy se používají vysoké koncentrace fosfátů nebo jsou přítomny jiné krystalizující pomocné látky, protože tyto podmínky pomáhají indukovat krystalizaci fosfátů. Roztoky obsahující vysoké koncentrace proteinu nebo nekrystalizovatelných rozpuštěných látek (např. sacharózy) inhibují krystalizaci fosfátů a minimalizují posuny pH.
kyselina citronová
kyselina citronová je jednou z nejčastěji používaných pufrů (Tabulka 1). Jedná se o trivalentní pufr obsahující tři karboxylové kyseliny s pKa 3,1, 4,8 a 6,4 (Tabulka 2) nabízející široké pufrovací rozsah5. Podle databáze neaktivních složek FDA se citrát nachází ve více než 100 schválených injekčních přípravcích, což mu dává velkou historii použití a prokazuje jeho bezpečnost.
studie srovnávající subkutánní injekce formulací pufrovaných citrátem proti com parable formulacím pufrovaným fosfátem nebo histidinem však prokázaly, že roztoky s citratebufferem vyvolaly větší bolest při subkutánní injekci18-20. I když tato bolest byla relativně krátká (méně než dvě minuty), vyvolává obavy z dodržování pacientových injekcí obsahujících citrát18. Při formulování s kyselinou citronovou je třeba uvést cílový profil přípravku a zamýšlený způsob podání. Pokud jsou určeny časté subkutánní injekce, může být vhodnější jiné pufrovací činidlo.
kyselina octová
kyselina octová má pKa asi 4,8, nabízí pufrovací rozsah 3,7-5,6 (Tabulka 2). Použití kyseliny octové je ideální pro formulaci proteinů stabilních v kapalném stavu za kyselých podmínek. Lyofilizace roztoků kyseliny octové je doprovázena zvýšením pH v důsledku sublimace těkavé kyselé formy pufru, zanechávající bazickou sůl. To potenciálně destabilizuje protein a ztěžuje kontrolu pH v lyofilizovaných léčivých přípravcích.
dodatečné schválené pufry
tromethamin
tromethamin (Tris) (pKa 8.1) má podobné vlastnosti jako fosfát (pKa 7.2) a může být použit jako náhrada v blízkosti neutrálních podmínek pH. Oba pufry vykazují změnu pH během zmrazení. Za stejných podmínek byl posun pH u tromethaminu (+2,1) přibližně stejný jako u fosfátu ( 1,8), ale v opačném směru (Tabulka 2)8.
volba jednoho pufru nad druhým by pak pravděpodobně závisela na citlivosti jednotlivého proteinu na směr posunu pH a na jakýchkoli specifických interakcích protein-pufr. Bylo prokázáno, že tromethamin a histidin jsou lepšími stabilizátory než fosfáty, když byl erytropoetin vystaven vysokému teplotnímu namáhání, což zabraňuje agregaci tím, že napomáhá reverzibilitě rozložení21. Ukázalo se, že Ure2p je stabilnější proti tvorbě fibrilů, když je formulován v tromethaminu versus fosfát22.
histidin
histidin, esenciální aminokyselina, je stále častější ve formulacích proteinových terapeutik. S pKa 6,1 je ideální pro proteinové formulace v blízkosti neutrálních podmínek (Tabulka 2).
bylo prokázáno, že histidin chrání monoklonální protilátku v kapalném i lyofilizovaném stavu před tepelným stresem23-25. Studie zkoumající stabilitu interferonu-tau ukázaly, že lékové formy obsahující histidin (následovaný Tris pak fosfátem) byly nejstabilnější proti agregaci indukované teplem. Tato stabilizace byla přičítána přímé vazbě histidinu na protein26. Během lyofilizace bylo prokázáno, že histidin a kyselina asparagová chrání protilátky tím, že působí jako dárce vodíkové vazby za účelem zachování intramolekulárních β-plechů24-25. Navíc bylo zjištěno, že histidin má vlastnosti antioxidantu kvůli své schopnosti vázat ionty železa a singlet oxygen24, 27. Nevýhodou použití histidinu je to, že bylo pozorováno, že roztoky histidinu mění barvu za zrychlených teplot a kyselého pH, jakož i extrakci železa z nerezové oceli24.
kyselina glukonová, mléčná a vinná
kyselina glukonová, kyselina mléčná a kyselina vinná jsou pomocné látky, které se téměř výhradně používají ve formulacích s malými molekulami. Glukonát vápenatý byl licencován pro léčbu popálenin fluorovodíku topickou aplikací. V závažnějších případech byla pro prevenci poškození tkání použita infuze čtyřprocentního roztoku glukonátu vápenatého ve fyziologickém roztoku28. Z 23 komerčně dostupných injekčních formulací obsahujících kyselinu mléčnou nalezených v databázi neaktivních složek FDA se pro biologii používají čtyři formulace-dva peptidy a dva proteiny. Z 12 formulací obsahujících kyselinu vinnou byl při formulaci proteinu použit pouze jeden. Tyto pufry mohou být vhodnými náhražkami acetátu a citrátu.
kyselina glukonová je sloučenina přirozeně vytvořená oxidací glukózy. Je to zajímavá sloučenina, protože má potenciál působit jako pufr, stabilizátor a chelatační činidlo, protože má strukturu obsahující karboxylové kyseliny a hydroxylové skupiny.
bylo prokázáno, že tartarát zlepšuje retenci monomeru nad citrátem v protilátkové formulaci při pH 4,0-4,5, pokud je uchováván jako kapalina při 25°C29. Předpokládá se, že hydroxylové skupiny v tartarátu, citrátu, malátu a potažmo laktátu a glukonátu by mohly dodávat stabilizující vodíkové vazby v amorfní fázi lyofilizovaného cake30-31.
asparagová a kyselina glutamová
jak asparagová, tak kyselina glutamová se nacházejí v infuzích podávaných kojencům a dětským pacientům s nedostatečnými plazmatickými koncentracemi aminokyselin. V Trophamin® jsou aspartát a glutamát infuzovány v koncentracích 22 mM a 34 mm32. Tyto koncentrace jsou dostatečně vysoké, aby zajistily dostatečné pufrování proteinových formulací.
bylo prokázáno, že kyselina glutamová, pokud je formulována se stejným množstvím argininu, zlepšuje stabilitu a rozpustnost intracelulárních proteinů23, 33 a také zabraňuje agregaci během rekonstituce23, 34-35. Studie na inzulínu a lidském sérovém albuminu naznačují, že přidání glutamátu a aspartátu bylo schopno inhibovat tvorbu agregátů36-38. Studie s pegfilgrastimem ukázaly, že stabilita pegfilgrastimu ve formě glutamátu nebo formiátu je srovnatelná s acetátem39.
meziprodukty cyklu kyseliny citronové
citrát, fumarát, α-ketoglutarát, malát a sukcinát jsou všechny meziprodukty v cyklu kyseliny citronové, u nichž bylo zjištěno, že jsou bezpečné a účinné jako pufry nebo protiionty v injekčních formulacích. Fumarát, α-ketoglutarát, malát a sukcinát byly použity v omezeném počtu přípravků (Tabulka 1). Je logické, že ostatní meziprodukty Krebsova cyklu mohou být rovněž vhodné pro použití v parenterálech. Mezi tyto sloučeniny patří akonitát, isocitrát a oxaloacetát. Jelikož jsou dvojmocné a trojmocné karboxylové kyseliny, mají pKa v rozmezí od 2,0 do 6,4, takže tyto sloučeniny jsou vhodné pro širokou škálu formulací (Tabulka 2).
vzhledem k omezenému použití těchto sloučenin jako pufrů není jasné, zda by stejná bolest při injekci spojená se subkutánními injekcemi citrátu byla spojena s těmito sloučeninami. Existují však i další výhody spojené s jejich použitím. Bylo prokázáno, že citrát indukuje gelaci roztoků protilátek, když koncentrace proteinu byla vyšší než 100 mg / ml. To bylo přičítáno trojmocné povaze vyrovnávací paměti. Sukcinát, který má pouze dvě karboxylové kyseliny, neměl stejný účinek při stejném pH40.
závěr
stanovení správného pH a pufrového systému je rozhodující pro uvedení bioterapeutik na kliniku a na trh. Potřeba nových pomocných látek a lepší porozumění existujícím pomocným látkám je velmi žádoucí. Histidin, tromethamin a řada dalších alternativních pufrů nabízejí výhody oproti konvenčně používaným pomocným látkám. Použití těchto alternativních pufrů nemůže dělat nic jiného, než pomoci rozšířit nástroje, které mají formulátory, a může umožnit vývoj terapeutického přípravku, který by jinak mohl selhat. Ke stabilizaci velkého počtu proteinových terapeutik ve vývoji by měly být všechny přístupy otevřeny k zvážení.
1. Osterberg, R. E., Demerlis, C. C., Hobson, D. W., Mcgovern, T. J. (2011) trendy v hodnocení bezpečnosti pomocných látek. Int. J. Tox. 30, 600-610
2. FDA (2005) pokyny pro průmysl: neklinické studie pro hodnocení bezpečnosti farmaceutických pomocných látek
5. Stoll, v. S., Blanchard, J. S. (1990) Buffery: principy a praxe. Metody v enzymologii. 182, 24-38
6. Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. (2008) měření a zvyšování rozpustnosti bílkovin. J. Pharm. Věda. 97, 4155-4166
7. Wang, W., Nema, s., Teagarden, D. (2010) agregace proteinů-cesty a ovlivňující faktory. Int. J. 390, 89–99
8. Williams – Smith, D. (1977) Changes in Apparent pH on Freezing Aqueous Buffer Solutions and their Relevance to Biochemical Electron-Paramagnetic-Resonance Spectroscopy. Biochem. J. 167, 593-600.
27. Wade, A. M., Tucker, H.N. (1998) Antioxidant Characteristics of L-Histidine. J. Nutr. Biochem. 9, 308-315
32. B. Braun Medical Inc. TROPHAMINE – isoleucine, leucine, lysine acetate, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, valine, cysteine hydrochloride, histidine, tyrosine, n-acetyl-tyrosine, alanine, arginine, proline, serine, glycine, aspartic acid, glutamic acid and taurine solution
34. Zhang M.Z., Wen J., Arakawa T., Prestrelski S.J. (1995) A New Strategy for Enhancing the Stability of Lyophilized Protein: The Effect of the Reconstitution Medium on Keratinocyte Growth Factor. Pharmacol. Res. 12, 1447–1452
36. Quinn, R., Andrade, J. D. (1983) minimalizace agregace neutrálních roztoků inzulínu. J. Pharm. Věda. 72, 1472-1473
39. Piedmonte, D. M., Treuheit, M. J. (2008) formulace přípravku Neulasta (pegfilgrastim). ADV. Drug Delivery Recenze. 60, 50–58
41. Sundaramurthi, P., Suryanarayanan, R., (2011) předpovídání sklonu krystalizace pufrů karboxylové kyseliny ve zmrazených systémech-význam pro lyofilizaci. J. Pharm. Věda. 100, 1288–1293
42. Sundaramurthi, P., Suryanarayanan, R., (2011) termofyzikální vlastnosti karboxylových a aminokyselinových pufrů při teplotách pod nulou: Význam pro stabilizaci zmrazeného stavu. J.Phys. Cheme. B. 115, 7154-7164
o autorovi
David sek získal BS v chemii na Bates College a MS v chemii a chemické biologii na Northeastern University. Má 10 let zkušeností jako vědec formulace a posledních osm let pracoval ve společnosti Pfizer studiem stability nových bioterapeutik.