y-kromosommikrodeletion hos en far och hans fyra infertila söner

Abstrakt

Mikrodeletioner av Yq är associerade med azoospermi och svår oligozoospermi. I allmänhet är män med borttagningar infertila och därför överförs inte borttagningar till söner såvida inte in vitro fertilisering (IVF) och intracytoplasmatisk spermieinjektion (ICSI) utförs. Vi rapporterar en ovanlig familj som kännetecknas av flera medlemmar med infertilitet och YQ-mikrodeletion. Fullständig reproduktionshistoria, spermaanalyser och blodprover framkallades från relevanta familjemedlemmar. DNA-beredning och kvantifiering utfördes med användning av kommersiella Kit. Totalt 27 par sekvensmärkta platser baserade primeruppsättningar specifika för y-mikrodeletionsregionens loci användes för screening. Södra blottar som använde borttagna i azoospermi (DAZ) och ribosomalt bindande motiv (RBM) cDNA analyserades sedan för bekräftelse. Proband, hans tre bröder och far befanns alla raderas för DAZ men inte RBM. Vid tidpunkten för analysen var probandens far azoospermisk medan hans fyra söner antingen var allvarligt oligozoospermiska eller azoospermiska. Till skillnad från sin far är de fyra sönerna infertila och har inga avkommor, förutom en av dem som uppnådde en dotter först efter IVF/ICSI-behandling för infertilitet. Mikrodeletioner av Yq som involverar DAZ-genen är associerade med ett variabelt fenotypiskt uttryck som kan inkludera uppenbarligen normal fertilitet.

introduktion

infertilitet förekommer hos ~14% av paren (Mosher, 1985) och avvikelser hos den manliga partnern uppskattas vara närvarande i upp till hälften av fallen (Swerdloff et al., 1985). Ansträngningar för att utvärdera orsakerna till azoospermi har visat att efter uteslutning av traditionellt igenkännliga orsaker (dvs onormal karyotyp, obstruktion, varicocoele, hormonell defekt etc.), de flesta fall (50-75%) är oförklarliga och kallas idiopatisk (Pryor et al., 1997). Nyligen har det rapporterats att upp till 30% av män med `idiopatisk’ azoospermi har mikrodeletioner av Y-kromosomen (Henegariu et al., 1993; Ma et al., 1993; Nagafuchi et al., 1993; Kobayashi et al., 1994; Najmabadi et al., 1996; Reijo et al., 1996; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Exakt hur och huruvida dessa mikrodeletioner orsakar azoo / oligozoospermi är föremål för både intensiv utredning och debatt.

viktigt för argumentet att Y mikrodeletioner orsakar infertilitet är observationen att fertila män sällan manifesterar y mikrodeletioner. Mikrodeletioner hos fyra av 200 studerade fertila män har rapporterats (Pryor et al., 1997). Emellertid var borttagningarna hos dessa män mycket små och representerade sannolikt obetydlig polymorfism. Relativt stora deletioner av det slag som förknippas med manlig infertilitet har inte rapporterats hos män med normal fertilitet. Även om det allmänt antas att dessa borttagningar uppstår de novo och att far till son överföring av Y-mikrodeletion inte skulle förväntas, några sällsynta fall av far till en son överföring av Y-kromosommikrodeletion har rapporterats (Kobayashi et al., 1994; Stuppia et al., 1996; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Vertikal överföring av en mikrodeletion som involverar den borttagna i azoospermia (DAZ) locus från far till en son har dock rapporterats i endast tre fall (Kobayashi et al., 1994; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Vi beskriver nu en fyra generationens familj där en azoospermisk far och hans fyra infertila söner alla delar en till synes identisk mikrodeletion som inkluderar DAZ locus. Denna familj representerar den första och enda rapporten om spontan vertikal överföring av Daz-radering till flera avkommor. Det ger bevis för att en enda YQ-mikrodeletion kan resultera i varierande fenotypiskt uttryck hos olika individer. Det är kliniskt signifikant, eftersom närvaron av en mikrodeletion inte är en absolut markör för infertilitet och kan associeras med uppenbarligen normal fertilitet.

material och metoder

Screening för YQ-mikrodeletion utfördes rutinmässigt för manlig infertilitet med hjälp av ett protokoll som granskats och godkänts av Institutional Review Board of College of Physicians & kirurger, Columbia University. Prover togs från patienter efter informerat samtycke.

spermaanalys

resultaten analyserades med hjälp av WHO-kriterier med ett Nikon-faskontrastmikroskop.

serumhormonkoncentrationer

follikelstimulerande hormon (FSH), luteiniserande hormon (LH) och testosteron mättes med fast fas, kemiluminescerande enzymimmunometrisk analys på två ställen (Immulite; Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA). Normala intervall för män är FSH <10 mIU/ml; LH <10 mIU/ml; och testosteron 270-1070 ng/dl.

genomiskt DNA

extraktion av genomiskt DNA från helblod utfördes genom lys av röda blodkroppar, följt av lys av vita blodkroppar och deras kärnor. Cellulära proteiner avlägsnades genom saltutfällning och genomiskt DNA utfälldes med isopropanol med användning av Puregene DNA extraktionssats (Gentra Systems, Inc. Minneapolis, MN, USA; katalognr. D-5004).

polymeraskedjereaktion (PCR)

Primers framställdes som torkade oligonukleotider på en automatiserad DNA-synthesizer (Perkin-Elmer Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Totalt 27 y-kromosomspecifika sekvensmärkta platser (STS) (Figur 1) valdes från en STS-karta (Vollrath et al., 1992). De inkluderar de tre föreslagna spermatogenesen loci AZFa, AZFb och AZFc (enligt Vogt et al., 1996) spänner över YQ-intervall 5, 6 och 7. Som ett snabbt screeningprotokoll användes ett PCR-multiplexsystem bestående av två till sex olika primerpar i totalt sex multiplexerade reaktioner (tabell i). Vid varje PCR-körning inkluderades en kvinnlig kontroll och en normal manlig kontroll. Alla PCR-reaktioner kördes i polykarbonatplattor (Techne-plattor) i en mj-forskningsautomat. PCR-betingelserna var väsentligen som tidigare beskrivits (Henegariu et al., 1993). Kort sagt, i en totalvolymreaktion på 14 kg användes 50 ng genomiskt DNA som mall, 1 kg primerstandardlösning (blandning i eller II eller III eller IV eller V eller VI bestående av 10 pmol per primer), 12 kg `PCR-kallblandning’ (1,5 mmol/l MgCl2, 0,2 mmol/l av varje dNTP, 5% DMSO, 1 kg Taq-polymerasreaktionsbuffert utan Mg2+), 1,25 IE Taq-DNA-polymeras (Promega) och 1 droppe olja. De kompletta blandningarna placerades direkt i en termocyklist som förvärmts till 94 kcal C. Cykelförhållanden för 27 cykler var: 94 C, 30 s (smältning), 55 C, 45 s (glödgning) och 72 C, 60 s (förlängning). Den sista förlängningstiden var 5 min. PCR-reaktionsprodukterna separerades sedan på 3% agarosgeler (Bio-Rad, ultrarent kvalitet) genom elektrofores i TBE-buffert. PCR-produkter färgades med etidiumbromid och visualiserades genom exponering för ultraviolett ljus. STS som inte visade någon förstärkning i multiplexreaktioner bekräftades med enkelreaktions-PCR med lämpliga positiva och negativa kontroller. En STS ansågs vara frånvarande efter tre förstärkningsfel.

Södra hybridisering

Södra blotting utfördes enligt etablerat protokoll (Sambrook et al., 1989). I korthet smältes 5 Baccarat genomiskt DNA med HindIII eller TaqI, kördes på en 0,7% agarosgel i standard TBE-buffert, överfördes till ett nylonmembran och hybridiserades med 32P-märkta sonder. DAZ-sonden var den renade insatsen av en plasmid (pDP1577) innehållande cDNA i full längd (Reijo et al., 1995). På samma sätt var RBM-sonden plasmidinsatsen av en RBM cDNA-klon (MK5) (Ma et al., 1993).

Faderskapsbestämning

faderskap för alla fyra söner bekräftades genom att visa den förväntade segregeringen av fyra mycket polymorfa autosomala markörer (Weber och May, 1989). Dessa var D21S156, D21S270, D13S132 och D13S159 med heterozygositeter av 0,83, 0,86, 0,84 respektive 0,90.

fluorescerande in situ hybridisering (fisk)

fisk för DAZ utfördes med Cosmid 63C9 (Saxena et al., 1996), med hjälp av etablerade metoder (Yu et al., 1996).

resultat

proband (individuell III 8 i Figur 2) och hans make (III-9) presenterades för reproduktiv-endokrinologi-Infertilitetskliniken vid Columbia-Presbyterian Medical Center med klagomål om primär infertilitet i 3 år. Testning avslöjade normal karyotyp och normala serumhormonnivåer medan spermananalyser visade allvarlig oligozoospermi (tabell II). Mikrodeletionsscreening med STS-baserad PCR avslöjade närvaron av en mikrodeletion i subinterval 6D–6F av Y-kromosomen lång arm (Figur 1). Under diskussionen rapporterade proband att hans två äldre bröder (III-4 och III-6) var kända för att vara azoospermiska och infertila. Efterföljande upparbetning avslöjade att alla tre bröderna hade en till synes identisk mikrodeletion. Testikelbiopsi utförd på en av dem (III-6) visade `Sertoli cell only’ syndrom.

upptäckten av mikrodeletion hos tre infertila bröder föreslog att deras far sannolikt skulle bära samma radering. En detaljerad studie genomfördes på resten av familjen som alla bodde i en liten stad i Dominikanska Republiken. En fullständig reproduktiv historia framkallades från de vuxna familjemedlemmarna. De familjeförhållanden som avbildades i stamtavlan (Figur 2) bekräftades genom att visa den förväntade segregeringen av flera autosomala polymorfa markörer (data visas inte) för de relevanta familjemedlemmarna (I-1, i-2, II-1, II-8 och II-1, II-2, III-1, III-4, III-6, III-8, III-10). Det fanns inga bevis för icke-faderskap. Grundliga cytogenetiska studier på relevanta familjemedlemmar (i-1, II-1, II-6, II-8, II-10, III-1, III-4, III-6, III-8, III-14, III-15, III-17, III-19 och IV-1) avslöjade normala karyotyper. Spermaanalys utfördes hos sju av de 16 männen och blodprover erhölls från de flesta familjemedlemmarna.

tabell II sammanfattar resultaten av spermaanalys och endokrin upparbetning av relevanta familjemedlemmar. Proband (III-8), hans far (II-1) och två av hans tre bröder (III-4, III-6) befanns vara antingen azoospermisk eller allvarligt oligozoospermisk. Probandens äldsta bror (III-1) avböjde spermaanalys. Dessutom visade sig probandens farbror (II-8) ha azoospermi och förhöjd FSH med lågt testosteron. Som visas i Figur 1, proband, hans far och tre bröder befanns alla ha mikrodeletion av Yq genom STS PCR-analys. Southern blotting med sonderna DAZ (Figur 3) och RBM (data visas inte) bekräftade att raderingen inkluderade DAZ-locus men inte RNA-bindningsmotivet (RBM) locus. FISKANALYS med DAZ Cosmid 63C9 (Saxena et al., 1996) av probandens fars (II-1) leukocyter visade enhetlig frånvaro av DAZ-locus (Figur 4).

upptäckten att individuell II-8 i stamtavlan var azoospermisk men inte hade en mikrodeletion var en överraskning. DAZ-locus i denna individ testades ytterligare genom sydlig analys med användning av DAZ-cDNA och ett annat restriktionsenzym (TaqI). Det kunde inte visa någon abnormitet i DAZ locus. Dessutom visade fisk med DAZ Cosmid 63C9 normal intensitet (data visas inte).

proband (III-8) och hans äldre bror (III-6) sökte infertilitetsbehandling. Efter omfattande rådgivning valde de in vitro fertilisering (IVF) och intracytoplasmatisk spermieinjektion (ICSI). Proband (III-8) och hans fru (III-9) genomgick två IVF-ICSI-cykler som misslyckades med att producera en graviditet sekundär till dåligt ovariesvar. Probandens bror (III-6) och hans fru (III-7) genomgick en cykel med kontrollerad ovariell hyperstimulering och nio oocyter hämtades. Elva mogna spermatozoer hittades i tre ejakulat på dagen för hämtning och användes för ICSI. Tre oocyter befruktade som därefter klyvs och överfördes. Hon levererade ett friskt kvinnligt barn (IV-2).

diskussion

vi rapporterar en exceptionell familj där en azoospermisk far och hans fyra infertila söner delar en till synes identisk Yq-mikrodeletion som involverar DAZ-locus. De-novo-mutationen som ledde till mikrodeletion av DAZ verkar ha sitt ursprung i probandens far (II-1). Denna borttagning förväntas orsaka azoo / oligozoospermi och manlig infertilitet, och ändå tänkte han spontant fem barn och var inte medveten om något fertilitetsproblem. Intressant är dock att alla fyra sönerna är infertila och är antingen azoospermiska eller allvarligt oligozoospermiska.

denna familj väcker flera problem med avseende på sambandet mellan YQ-mikrodeletion och infertilitet. För det första bekräftar det att vertikal överföring av YQ-mikrodeletion är möjlig och kan leda till efterföljande infertilitet hos manliga avkommor. För det andra är det uppenbart att samma radering kan resultera i olika fenotyper hos olika individer. Även om Fadern (II-1) av de fyra pojkarna i denna familj var azoospermisk vid analystidpunkten, födde han sitt första barn vid 25 års ålder och hans sista vid 38 års ålder. Således hade han en viss grad av fertilitet under ett stort antal år. På samma sätt innebär mikrodeletion av Y-kromosomen, särskilt DAZ, inte nödvändigtvis en livslång historia av azoospermi och utesluter inte heller bildandet av en stor familj. Hans fyra söner är å andra sidan infertila och antingen azoospermiska eller allvarligt oligozoospermiska.

DAZ-genen har föreslagits som azoospermia-faktorn på Y-kromosomen. Denna familj visar tydligt att även om DAZ kan ha en kritisk roll i spermatogenes, är det inte nödvändigt för fertilitet. Dessutom kan total förlust av Daz-genklustret associeras med en histologisk bild av `endast Sertoli-celler’ såväl som spermiermognadstopp (Foresta et al., 1997; Pryor et al., 1997). Flera författare har funnit en dålig korrelation mellan placeringen av Y-mikrodeletioner (inklusive DAZ-deletioner) med patientens kliniska och histologiska fenotyp (Reijo et al., 1995, 1996; Vogt et al.; 1996; Silber et al., 1998). Resultaten i denna familj är överens om att en sådan korrelation kan visa sig vara ganska problematisk. Testikulärbiopsi hos probands bror (III-6) visade en bild av `Sertoli-cellen bara’ medan proband (III-8 med spermier 0,5 106/ml) klart skulle förväntas ha en viss grad av spermamognad på biopsi. Dessutom kan testikelbiopsi inte vara representativ för hela testikeln eftersom det kan finnas geografisk heterogenitet för spermatogenes som i enskilda III-6 vars ejakulat innehöll mogna spermatozoer.

vi kan bara spekulera om grunden för fenotypiska skillnader mellan familjemedlemmar med samma radering. Det är välkänt att identiska deletioner inom autosomer kan resultera i olika fenotyper (Schinzel, 1994). Man kan postulera att sådana skillnader är konsekvenser av varje individs exponering för sin miljö eller uttryck av olika modifierande gener. En bördig far har beskrivits med en mikrodeletion som utvidgades när den överfördes till sin infertila son (Stuppia et al., 1996). Även om variabla förlängningar vid gränserna för raderingen kan finnas mellan våra olika familjemedlemmar, kan dessa molekylära förlängningar inte särskiljas genom intervallmappning. Genom PCR-analys misslyckades samma STSs att förstärka i våra fem individer och sydlig hybridisering med DAZ-sonden bekräftade en fullständig radering av detta genkluster. Även om det är möjligt att de observerade borttagningarna faktiskt inte är identiska och angränsande områden kan innehålla viktiga gener som modulerar graden av fenotypiskt uttryck, indikerar dessa resultat fortfarande en stor överlappning av raderat Y-DNA (inklusive förlusten av DAZ-genkluster) i varje individ i denna unika familj.

vi fascinerades av det faktum att probandens farbror (II-8) har infertilitet och azoospermi men ingen uppenbar mikrodeletion genom STS-testning. Eftersom southern blot-analys med både RBM-och DAZ-sonderna samt FISKANALYSER med en DAZ-kosmid var helt normala, vi tvingas dra slutsatsen att han har en annan etiologi som ligger bakom hans infertilitet. Visserligen är det möjligt att han kan ha en mindre eller punktmutation/störning eller proximal/distal omläggning som inte kan detekteras med nuvarande metoder. Han gav ingen historia av exponering för gonadotoxiner eller andra definierbara faktorer som sannolikt skulle påverka spermatogenesen.

fram till nyligen har y-mikrodeletion haft liten klinisk betydelse, eftersom en man med radering i allmänhet inte kommer att reproducera. Men med hjälp av ICSI och testikulär spermaaspiration (TESA), i kombination med IVF, är det nu möjligt för oligo/azoospermiska män med Y-mikrodeletion att uppnå graviditeter (Mulhall et al., 1997; Silber et al., 1998 och individuell III-6). Detta har främjat oro för att sådana graviditeter kan producera manliga avkommor med liknande mikrodeletioner och efterföljande infertilitet (Reijo et al., 1996; Girardi et al., 1997; Kremer et al., 1997). Faktum är att Yq-mikrodeletion kan överföras till manliga avkommor via ICSI (Kent-First et al., 1996). Familjen vi rapporterar föreslår att män med YQ-mikrodeletioner (som individ II-1) som uppnår graviditeter kommer att överföra samma mikrodeletion och risken för infertilitet till sina söner (individer III-1, III-4, III-6, III-8). Därför bör patienter erbjudas y-mikrodeletionsscreening före ICSI och de bör få råd om säkerheten att överföra Yq-mikrodeletionen och eventuellt infertilitet till sina söner. Eftersom mer forskning är inriktad på genetiska etiologier av manlig infertilitet, bör identifiering av gener som är involverade i spermatogenes ge insikt i patofysiologin för manlig infertilitet och en mer rationell grund för att initiera terapi.

vi tackar familjerna för deras samarbete i studien; Dr David C. Page för att tillhandahålla DAZ cDNA-sonden och hans ovärderliga hjälp med detta manuskript; Dr Kun Ma för att tillhandahålla MK5 (RBM1) cDNA-sonden; Dr Peter Vogt för DNA från YQ-mikrodeleterade individer som används för att validera vår STS PCR-metodik; och CC Yu och Patricia Lanzano för deras ovärderliga tekniska hjälp.

denna studie finansierades delvis av Columbia Presbyterian Medical Center Office of Clinical Trials House Staff Awards.