singelmutation i en mycket konserverad region av kloramfenikolacetyltransferas möjliggör isobutylacetatproduktion direkt från cellulosa av Clostridium thermocellum vid förhöjda temperaturer

bakteriestammar och plasmider

bakteriestammar och plasmider som används i denna studie listas i tabell 2. Clostridium thermocellum dsm1313 bisexuell HPT (m1354) stam användes som värd för esterproduktionen vid förhöjda temperaturer. Det bör noteras att raderingen av hypoxantinfosforbosyltransferasgenen (hpt, Clo1313_2927) i vildtypen DSM1313 möjliggör genteknik med 8-azahypoxantin (8-AZH) motval; denna radering har ingen känd negativ effekt på celltillväxt och metabolism . Plasmid pNW33N, innehållande CATSa, är termostabil och användes för att uttrycka olika katter i C. thermocellum. PET-plasmiderna användes för molekylär kloning och enzymuttryck i E. coli.

kemikalier och reagenser

alla kemikalier köptes från Sigma-Aldrich (MO, USA) och/eller Thermo Fisher Scientific (MA, USA), om inte annat anges. För molekylär kloning erhölls restriktionsenzymer och T4-ligas från New England Biolabs (MA, USA). Phusion Hot Start II DNA-polymeras användes för polymeraskedjereaktion (PCR).

Media och odling

för molekylär kloning och proteinuttryck odlades E. coli-stammar i lysogenbuljong (LB) innehållande lämpliga antibiotika om inte annat anges. För in vivo karakterisering av CATSa i E. coli, M9 hybridmedium med 20 g/L glukos användes. För C. thermocellum kultur, MTC minimal medium eller CTFuD-NY medium användes som specificeras i experimenten. Optisk densitet (OD) mättes med en spektrofotometer vid 600 nm våglängd (Spectronic 200+, Thermo Fisher Scientific, MA, USA).

analys av flera sekvensinriktningar

analys av flera sekvensinriktningar (MSA) utfördes med användning av MEGA7 . Proteinsekvenser justerades av ClustalW och visualiserades av ESPript 3.0 (http://espript.ibcp.fr) . De viktigaste funktionerna i proteinstrukturer av 3U9F , 4CLA och 2xat extraherades från CAT_SALTI , CAT3_ECOLIX respektive CAT4_PSEAE.

molekylär modellering och dockningssimuleringar

tredimensionella (3D) strukturer

3D-strukturen för CATSa och alkoholer av intresse genererades först med Swiss-Model och ’Builder’ – verktygen för MOE (Molecular Operating Environment software, version 2019.01). 3D-strukturen hos det dubbla substratbegränsade CATSa-komplexet (dvs. acetyl-CoA–isobutanol–CATSa) erhölls genom att extrahera en isobutanol från isobutanol–CATSa-komplexet och sedan tillsätta det till acetyl–CoA-CATSa-komplexet. Alla strukturer bereddes av ’QuickPrep’ – verktyget i MOE med standardparametrar och optimerades ytterligare genom energiminimering med amber10:EHT-kraftfältet.

Dockningssimulering

för att utföra dockningssimuleringar söktes den potentiella bindningsfickan med hjälp av verktyget ’Site Finder’ i MOE. Den bäst poängsatta platsen, i överensstämmelse med de rapporterade katalytiska platserna , valdes för ytterligare studier. Dockningssimuleringar utfördes som tidigare beskrivits . I korthet dockades acetyl-CoA och varje alkohol med hjälp av det inducerade fit-protokollet med Triangelmatchningsplaceringsmetoden och London-POÄNGFUNKTIONEN. Efter dockningssimuleringarna valdes den bäst poängsatta bindningspositionen, som visar den avgörande interaktionen mellan återstoden och substratet vid rot-medel-kvadratavvikelse (RMSD) < 2 kg. Som ett exempel, för acetyl-CoA-dockningen, valdes bindningspositionen som uppvisar vätebindningen mellan hydroxylen av Ser-148 och N71 av CoA . För alkoholdockningen valdes bindningspositionen som visar vätebindningen mellan N3 av His-189 och hydroxylen av alkohol .

i silico mutagenesanalys

i silico mutagenesanalys av acetyl-CoA–isobutanol–CATSa-komplexet utfördes som tidigare beskrivits . Specifikt användes verktygen’ alanine scan ’och’ rest scan ’ av MOE för att identifiera de potentiella restkandidaterna för mutagenes.

molekylär kloning

Plasmidkonstruktion

plasmider konstruerades med standardmolekylär kloningsteknik av ligasberoende metod och/eller Gibson-montering med användning av primrarna listade i ytterligare fil 1: Tabell S1. De konstruerade plasmiderna infördes i E. coli TOP10 genom värmechocktransformation. Kolonier isolerade på en selektiv platta screenades PCR och plasmid renades. De renade plasmiderna verifierades via Sanger-sekvensering innan de transformerades till E. coli BL21 (DE3). Platsstyrd mutagenes utfördes med användning av QuickChange-platsstyrd mutagenesprotokoll för Macau med reducerad överlappslängd eller Gibson-monteringsmetod . För C. thermocellum engineering konstruerades plasmid pHS005 först och modifierades sedan till pHS0024. pHS0024 har ingen hpt vid nedströms operonen, medan andra sekvenser av plasmid är identiska med pHS005.

Transformation

de konventionella kemiska transformations-och elektroporationsmetoderna användes för transformation av E. coli respektive C. thermocellum. För C. thermocellum, metoden modifierades emellertid något som beskrivs här. För det första odlades C. thermocellum M1354 (Tabell 2) i 50 mL ctfud-NY-medium vid 50 kcal C inuti en anaerob kammare (Bactron300, Sheldon manufacturing Inc., ELLER, USA). Cellkulturen med OD i ett intervall av 0,8–1,0 kyldes ned vid rumstemperatur under 20 min. Utöver denna punkt utfördes alla steg utanför kammaren. De kylda cellerna skördades vid 6500 kg och 4 C i 20 minuter. Cellpelletsna tvättades två gånger med iskallt Milli-Q-vatten och resuspenderades i 200 oc-l av transformationsbufferten bestående av 250 mm sackaros och 10% (v/v) glycerol. Flera 30 occl alikvoter av de elektrokompetenta cellerna lagrades omedelbart vid – 80 oc C för vidare användning. För elektroporation tinades de elektrokompetenta cellerna på is och inkuberades med 500-1000 ng metylerade plasmider under 10 min. Därefter överfördes cellerna till en iskyld 1 mm gap elektroporationskuvett (BTX Harvard Apparatus, MA, USA) följt av två på varandra följande exponentiella sönderfallspulser med 1.8 kV, 350 OC, och 25 oC. Pulserna resulterade vanligtvis i en 7,0–8,0 ms tidskonstant. Cellerna resuspenderades omedelbart i förvärmd färsk CTFuD-NY och återhämtades vid 50 kcal C under anaerobt tillstånd (90% N2, 5% H2 och 5% CO2) inuti ett gummihöljt Balchrör. Efter 0-12 h återhämtning blandades cellerna med smält ctfud-NY-agarmedium kompletterat med 15 occygg/mL tiamfenikol. Slutligen hälldes mediumcellblandningen på en petriskål och stelnade inuti den anaeroba kammaren. Plattan inkuberades vid 50 kcal C upp till 1 vecka tills kolonier uppträdde. Transformationseffektiviteten var 2-100 kolonibildande enheter per plasmid av usci (CFU/usci plasmid).

in vivo-karakterisering av CATSa och dess varianter i E. coli

för in vivo-karakterisering av CATSa och dess varianter i E. coli utfördes kulturer med hög celldensitet som tidigare beskrivits med tillsats av 2 g/L av olika alkoholer. För in situ-extraktion av estrar överlagrades varje rör med 25% (v/v) hexadekan. För att bekräfta proteinuttrycket av CATSa och dess varianter odlades 1% (v/v) stamceller över natten vid 37 C och 200 rpm i 15 mL odlingsrör innehållande 5 mL LB-medium och antibiotikum. Därefter överfördes 4% (v/v) av nattkulturerna till 1 mL LB-medium innehållande antibiotikum i en 24-brunnsmikroplatta. Kulturerna odlades vid 37 C och 350 rpm med användning av en inkuberande mikroplatskakare (Fisher Scientific, PA, USA) tills OD nådde 0,4–0,6 och inducerades sedan av 0.1 mm isopropyl-2-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) för 4 h med en andas-lätt tätning membran för att förhindra avdunstning och korskontaminering (cat# 50-550-304, Research Products International Corp., IL, USA). Proteinproverna erhölls med användning av B – per komplett reagens (cat# 89822, Thermo Scientific, MA, USA), enligt tillverkarens instruktioner och analyserades av SDS-PAGE.

Enzymkarakterisering

his-tag rening

för enzymuttryck inokulerades en nattkultur med en 1:50-förhållande i färskt LB-medium innehållande 1 mM IPTG och antibiotikum, följt av 18 C-inkubation över natten (upp till 20 h) i en skakningsinkubator vid 200 rpm. De inducerade cellerna skördades genom centrifugering vid 4 C och 4700 g i 10 min. Cellpelleten tvättades sedan en gång med Milliporvatten och resuspenderades i B-per komplett reagens. Efter 30 min inkubation vid rumstemperatur centrifugerades blandningen vid 17,000 xnumx xnumx g för 2 min. Supernatanten samlades in och betecknades som råextrakt. För His-tag-rening inkuberades det råa extraktet med HisPur Ni–nta superflow-agaros i en sats som tillverkaren rekommenderar. Sedan tvättades hartset med minst tre volymer tvättbuffert, bestående av 50 mM Tris–HCl (pH 8,0), 300 mM NaCl, 10 mM imidazol och 0,1 mM EDTA. De hartsbundna proteinerna eluerades med 300 oc-elueringsbuffert innehållande 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 300 mM imidazol och 0,1 mm EDTA. Det eluerade provet avsaltades sedan och koncentrerades via en Amikonfilterkolonn med 10 kDa molekylvikt cut-off. Slutligen suspenderades proteinprovet i 200 occyl av 20 mM Tris-HCl-Buffert (pH 8.0). Proteinkoncentrationen mättes genom Bradford-analysen med bovint serumalbumin (BSA) som referensprotein.

termisk skiftanalys

för att mäta proteinsmältningstemperatur (Tm) användes en termofluoranalys med SYPRO Orange . Om 10-250 occurg av His-tag renat protein blandades med 5 occur SYPRO Orange i en 50 occurl slutlig volym i en 96-brunns qPCR platta. Plattan förseglades med PCR-lock innan analysen kördes. Stepones PCR-maskin i realtid (Applied Biosystems, CA, USA) användes för att köra analysen med följande parametrar: ROX reporter, 1 C-ökning per cykel, 1-min-håll vid varje cykel och temperaturområde från 20 till 98 C. data samlades in, exporterades och bearbetades för att beräkna Tm.

5,5′-ditiobis-(2-nitrobensoesyra) (DTNB)-analys

reaktionshastigheten för varje katt bestämdes genom en dtnb-analys i en 384-brunnsplatta. Den totala reaktionsvolymen var 50 oktyl med reaktionsbufferten bestående av 50 mM Tris-HCl (pH 8,0). Koncentrationerna av acetyl-CoA (CoALA Biosciences, TX, USA) och alkoholer varierades enligt vad som anges i varje experiment. Slutliga enzymkoncentrationer på 0,05 Kg / mL och 10 kg/mL användes för reaktionerna mot kloramfenikol respektive alkoholer. Reaktionskinetik samlades in genom att mäta absorbans vid 412 nm varje minut i 1 h vid 50 CCB i en mikroplattläsare (Synergy HTX microplate reader, BioTek). Reaktionshastigheten beräknades med användning av utrotningskoefficienten från en standardkurva för fritt koenzym A (MP Biomedicals, OH, USA) under samma tillstånd. Det bör noteras att eftersom den maximala driftstemperaturen som rekommenderas för plattläsaren är 50 CCG, utfördes enzymanalysen med hög genomströmning för CAT vid förhöjda temperaturer endast för att bestämma enzymkinetikparametrar.

beräkning av kinetiska parametrar för reaktionshastigheter

parametrarna för Michaelis–Menten rate law (Eq. 1) beräknades för varje enzym enligt följande. Först utfördes linjär regression på data som samlats in från en mikroplattläsare för att identifiera initiala reaktionshastigheter, \(y_{i}\), vid olika initiala substratkoncentrationer, \(s_{i}\), där i = {1,2,…,n} är antalet datapunkter som samlats in. Sedan passade dessa initiala reaktionshastigheter och associerade initiala substratkoncentrationer för alla replikat samtidigt till Michaelis–Menten-modellen (Eq. 1) med robust icke-linjär regression (Eq. 2) med en soft-L1-förlustestimator (Eq. 3) som implementeras i scipy numerical computing library v1. 2. 0 :

problemet med minsta kvadrater bestämmer parametrarna \(k_{\text{m}}\) och \(v_{ \text{max} }\) genom att minimera skillnaden mellan modellens förutsagda reaktionshastigheter \(v_{i}\) och uppmätta reaktionshastigheter \(y_{i}\) (Eq. 2). En utjämningsfunktion \(\rho \left (z\ right)\) används för att göra det minsta kvadratproblemet motståndskraftigt mot avvikare (Eq. 3). På grund av det objektiva motståndet mot avvikare och undvikande av fel som härrör från konventionella linjäriseringsmetoder ger robust icke-linjär regression den mest exakta parameteruppskattningen för Michaelis–Menten-modellen .

isobutylacetatproduktion i C. thermocellum

cellobiosfermentering

Isobutylacetatproduktion från cellobios i C. thermocellumstammar utfördes genom tvåstegs biokonversionskonfigurationen. Celler odlades först i MTC minimalt medium innehållande 5 g/L cellobios i ett gummiklätt balchrör tills OD nådde 0,8–1.0. Cellerna kyldes ned vid rumstemperatur i 20 minuter och centrifugerades vid 4700 kg och 4 kg C i 20 minuter. Efter avlägsnande av supernatanten resuspenderades celler i samma volym färskt MTC-minimalt medium innehållande 2 g/L isobutanol i en anaerob kammare. Cellsuspensionen delades sedan upp i 800 UCL i ett 2,0 mL skruvlock mikrocentrifugrör med ett 200 UCL hexadekanöverdrag. Cellerna inkuberades vid 55 C i 24 timmar följt av analys av gaskromatografi i kombination med en masspektrometer (GC/MS) för att kvantifiera mängden producerad isobutylacetat.

cellulosafermentering

för cellulosafermentering användes modifierat MTC-medium (C-MTC-medium). 20 g/L Avicel PH – 101 användes som en enda kolkälla istället för cellobiose och 10 g/L Moppar tillsattes för att öka buffertkapaciteten. Initialt pH justerades till 7, 5 med 5 m KOH och autoklaverades. I en anaerob kammare inokulerades 0,8 mL cellodling över natten i 15,2 mL C-MTC-medium (1:20 inokuleringsförhållande) med 4 mL överlagrad hexadekan. Varje rör innehöll en liten magnetisk omrörare för att homogenisera cellulosa. Det gummiklädda Balchröret inkuberades i ett vattenbad i samband med en temperaturregulator inställd på 55 kcal C och ett magnetiskt omrörningssystem. Efter pH-justering med 70 oc 5 m KOH–injektion, 800 oc cellodling och 200 oc hexadekanskikt samplades var 12: e timme. kultur pH bibehölls inom ett intervall av 6,4-7,8 under jäsningen.

celltillväxt övervakades genom mätning av pelletsprotein. Cell-cellulosapelleten från provtagningsvolymer på 800 oc-l tvättades två gånger med Milli-Q-vatten och suspenderades med 200 oc-l-lysbuffert (0.2 M NaOH, 1% SDS) följt av en timmes inkubation vid rumstemperatur. Därefter neutraliserades lösningen med 50 occl 0,8 M HCl och späddes med 550 occl vatten. Blandningen centrifugerades vid 17,000 xnumx xnumx g för 3 min. Proteinkoncentrationen från supernatanten analyserades med den tvättmedelskompatibla Bradford-analysen (Thermo Scientific, WA, USA). Den återstående pelleten kokades i en 98 C-ugn i en timme innan den kvantifierade kvarvarande cellulosa.

Restcellulosa kvantifierades med fenol–svavelsyrametoden med vissa modifieringar. Det kokta provet tvättades två gånger med Milli-Q-vatten och suspenderades i 800 oc-l-vatten för att göra motsvarande volym till originalet. Provet homogeniserades genom pipettering och vortexing för 10 s, och 20 oC-l av det homogeniserade provet överfördes till ett nytt 2,0 mL mikrocentrifugrör eller 96-brunnsplatta och torkades över natten i en 55 C-ugn. Den torkade pelleten suspenderades i 200 oc 95% svavelsyra och inkuberades i en timme vid rumstemperatur. Efter att pelleten löstes fullständigt tillsattes 20 oC 5% fenol och blandades med svavelsyralösningen. Efter 30 min inkubation vid rumstemperatur överfördes 100 occyl av provet till en ny 96-brunnsplatta och absorbansen vid 490 nm mättes. Absorbansen omvandlades till cellulosakoncentration genom standardkurvan för Avicel PH-101 behandlad med samma procedur.

analysmetoder

högpresterande vätskekromatografi (HPLC)

extracellulära metaboliter kvantifierades med användning av ett högpresterande vätskekromatografi (HPLC)-system (Shimadzu Inc., MD, USA). 800 oktyl av odlingsprover centrifugerades vid 17 000 oktyl g i 3 min, och sedan filtrerades supernatanterna genom 0,2 oktylfilter och kördes med 10 mn H2SO4 mobil fas vid 0,6 mL / min på en Aminex HPX-87H (Biorad Inc., CA, USA) kolonn vid 50 msk C. Brytningsindexdetektor (RID) och ultraviolett detektor (UVD) vid 220 nm användes för att övervaka koncentrationer av sockerarter, organiska syror och alkoholer.

gaskromatografi i kombination med masspektroskopi(GC / MS)

estrar mättes med GC (HP 6890, Agilent, CA, USA) utrustad med en MS (HP 5973, Agilent, CA, USA). För GC-systemet användes Zebron ZB – 5 (Phenomenex, CA, USA) kapillärkolonn (30 m 0,25 mm 0,25 mm 0,25 mm) för att separera analyter och helium användes som bärare med en flödeshastighet av 0,5 mL/min. Ugnstemperaturen programmet fastställdes enligt följande: 50 °C initial temperatur 1 °C/min ramp upp till 58 °C, 25 °C/min ramp upp till 235 °C, 50 °C/min ramp upp till 300 °C, och 2-min baka ut till 300 °C. 1 µL av samplade hexadecane lagret var injiceras i kolumnen i splitless läge med en injektor temperaturen 280 °C. För MS-systemet användes valt jonläge (SIM) för att detektera och kvantifiera estrar med följande parametrar: (i) etylacetat, m/z 45.00 och 61.00 från 4.2 till 4.6 min retentionstid (RT), (ii) isopropylacetat, m/z 45 och 102 från 4.7 till 5.0 min RT, (iii) propylacetat, m/z 59 och 73 Från 5.2 till 5.8 min RT, (iv) etylisobutyrat, m/z 73 och 116 från 6,1 till 6,6 min rt, (v) isobutylacetat, m/z 61 och 101 från 6,6 till 7,6 min rt, (vi) butylacetat, m/z 61 och 116 från 7,7 till 9,2 min rt, (VII) isobutylisobutyrat, m/z 89 och 129 från 10,1 till 12.5 min RT, (viii) bensylacetat, m/z 108 och 150 från 13,1 till 13,8 min RT och (ix) 2-fenetylacetat, m/z 104 och 121 från 13,8 till 15,5 min RT. Isoamylalkohol och isoamylacetat användes som de interna standardanalyterna. Estrarna identifierades av RT och kvantifierades av toppområdena och standardkurvorna. Standardkurvor bestämdes med användning av rena estrar utspädda i hexadekan i koncentrationer av 0,01 g / L, 0,05 g/ L, 0,1 g/ L, 0,5 g/ L och 1 g/L.