växter och patogenen
den vanliga isväxten (Mesembryanthemum crystallinum L.) odlades i ett växthus som beskrivs av kutubbiak et al. . Efter utseendet av det 3: e bladparet bevattnades en uppsättning växter med 0,4 M NaCl för att inducera Crassulaceansyrametabolism (CAM-växter) medan en annan bevattnades ytterligare med kranvatten (C3-växter). Efter 12 dagar bekräftades induktionen av CAM i de NaCl – behandlade växterna genom att mäta det dagliga askorbinmalatet i bladcellsapet. Därefter ympades blad av 2: a bladpar av C3-och KAMVÄXTER med Botrytis cinerea enligt Kuubbiniak et al. .
klorofyll en fluorescensavbildning
Mini-versionen av en bildbehandling-Pam klorofyll Fluorometer M-serien (Walz, Effeltrich, Tyskland) utrustad med en bladhållare användes för att registrera fluorescensavbildning (bildbehandling-Pam M-serie klorofyll Fluorometer) . Fluorometern är en bladklämmemodell för fältapplikationer. Bladhållaren säkerställer att bladet hålls horisontellt mot ljuskällan för att undvika heterogen belysning över olika delar av bladprovet. Provtagningspositionerna valdes för att vara lika fördelade längs midriben, men de skilde sig något för alla blad på grund av dess storlek och morfologi och tekniken att placera löv i hållaren. För att identifiera effekterna av biotisk stress endast, och för att undvika införandet av artefakter i klorofyllfluorescensmätningsproceduren, inga referensmärken som tillåter bladbildreferenser applicerades på bladen. Klorofyllfluorescens från vanliga isväxtblad erhölls genom att definiera intresseområde (Aoi-verktyg) med hjälp av Imaging Win 2.41 a-programvaran.
med Imaging-PAM övervakades det aktuella fluorescensutbytet (Ft) kontinuerligt. Växter var mörka anpassade för 20 min. Vid applicering av en mättnadspuls bestämdes fluorescensutbytet på mörk nivå (Ft = F0) och det maximala fluorescensutbytet (Fm). Det maximala PSII-kvantutbytet, Fv / Fm och kvantutbytet av reglerad och icke-reglerad energiavledning i PSII, Y(NPQ) och Y(NO) avbildades. Fv / Fm beräknades enligt ekvationen: Fv / Fm = (Fm − F0) Fm. Y (NPQ) beräknades enligt Kramer et al. med formeln: 1-Y (II) − 1/(NPQ + 1 + qL (Fm/F0-1)). Y (NO) beräknades enligt Kramer et al. med ekvationen: Y (Nej) = 1/. Processen för avbildning ger pseudo-färg (indexerade färgläge) bilder av biologiskt material med en upplösning 640 280 xnumx xnumx xnumx pixlar som motsvarar visningsfältet för de fysiska dimensionerna 32 24 xnumx xnumx mm.
de infekterade bladen från C3-och CAM-växterna togs för CHL en fluorescensanalys vid tidpunkten för ympning och 3, 6, 9, 24, 32, 48, 54 och 72 h efter ympning. Chl en fluorescens mättes för bifogade blad av 2: a bladparet från tre C3-och KAMVÄXTER som kommer från två oberoende upprepningar av växtodling. Varje blad som tagits för analys screenades separat vid alla tidpunkter (Fig. 1). Representativ serie med nio bilder (en för varje tidpunkt) av Y(NO), Y(NPQ) och Fv/Fm för C3-och CAM-isväxter har bearbetats för att mäta förändringar av dessa parametrar i ett valt område av bladblad som screenats över tiden. Som jämförelse var y(NO), Y (NPQ) och Fv/Fm i genomsnitt data från hela bladregionerna som visas i Fig. 2 erhölls. Resultaten av bildjustering och mätningen av spatiotemporal pattering av biotisk stressutbredning i löv med föreslagen metod exemplifierades på Y(NO) bilder.
exempel på bilder av kvantutbyte av icke-reglerad energiavledning i vanliga isväxtblad. Gäller PSII Y(NO) av C3 (a–d) och CAM (e–h) fluorescensparametrar. Bladfragmentet innehåller platsen för patogeninokulering och symtom på stressutbredning
exempelbild av C3 common ice plant leaf med utvalda regioner av intresse. Manuellt gjorda val i firmware editor täcker de infekterade (1), symptomlösa (2) såväl som midribområdena (3)
Bildjustering
mekanismen för insamling av PAM-bilddata i tidssekvens resulterar i att bladfragmentet flyttas i synfältet mellan enskilda tidpunkter (Fig. 1). På grund av förändringen av bladpositionen har sådana egenskaper som midrib och inokuleringsställena både olika plats och orientering. Dessutom kan effekten av omskalning observeras. För att korrekt bedöma stressutbredning ska visningsfälten synkroniseras ömsesidigt förutsatt att en av dem är en referens (fast) bild och resten av bilderna ska anpassas till den fasta. Detta tillvägagångssätt är känt inom medicinsk bildbehandling som bildregistrering . Den grundläggande registreringsuppgiften för fluorescensbilderna är att hitta likhetstransformationen som består av lämplig rotation, översättning och skalning. Bladytan böjning och vikning av löv från stress förekommer endast i lokala regioner av enstaka bilder och är av mindre betydelse för den globala bildjusteringen. De kan kompenseras vid registreringsprocessen efter bearbetning genom olinjära transformationer som t .ex. tunnplatta, ytsplines och demonmappningar.
fluorescensbilderna tas som en serie bilder i fördefinierade tidsintervall på ungefär samma bladregion. De karakteristiska elementen i betraktad stapel av bilder representerar huvudsakligen bladvener. Men de är dåligt urskiljbara från bildinnehållet på grund av begränsad kontrast samt färgmode för PAM-bildbehandling. Områdena med stresssymtom som visuellt dominerar innehållet kan ändras mellan bilder i en enda serie. I en sådan situation skulle automatisk registrering misslyckas.
de mest populära, automatiska toppmoderna metoderna är baserade på jämförelse av bildintensitet med vissa korrelationsmått (intensitetsbaserade metoder) eller förlita sig på att söka i fasta och rörliga bilder för korrespondensen mellan valda bildfunktioner som punkter, linjer och konturer (funktionsbaserade metoder) . Ingen av dessa tillvägagångssätt möjliggör korrekt registrering av Pam-fluorescensbilder av vanlig isväxt, vad som har verifierats och visats i exemplen som ingår i kompletterande material (ytterligare fil 1). Resultaten som presenteras där bekräftar att orsaken till misslyckade automatiska registreringar är den starka Fördunklingen av bildregioner med bevarade funktioner genom dynamiska förändringar i bildinnehållet orsakat av infektion i bladvävnaden. Tester av de populära metoderna utfördes både av Registreringsuppskattaren i Matlab och i Fiji-miljön .
algoritmen för Pam-bildregistrering designades i Matlab-miljö baserat på den uppsättning kontrollpunkter som valts manuellt av en expert. För att ställa in motsvarande kontrollpunkter i varje bild användes funktionen cpselect of Control Point Selection Tool från Image Processing Toolbox. Bilder redigerades i par inklusive en fast bild och en rörlig bild. Den första bilden som förvärvades strax efter patogeninokulering antogs som en fast (referens) bild. Genom interaktiv punktmappning kan användaren inte bara peka på de synliga konturerna av nerver utan också andra karakteristiska element såsom injektionspunkten, platser längs patogenutbredningen såväl som de mest uppenbara epidermala blåscellerna (Fig. 3).
kontrollpunkter som valts av experten. Exempel y (NO) bilder av ett bladfragment av en kam vanlig isväxt: en fast (referens) Bild, b rörlig bild som ska anpassas till den fasta
flera par kontrollpunktsplatser, fördelade så mycket som möjligt över bladbildytan, är tillräckliga för att korrekt rikta in bilderna på samma blad som grovt betraktas som en styv kropp. Bredare fördelning av kontrollpunkter förbättrar känsligheten för bildmatchning men begränsas av bildvisningsfältet som beskärs efter justeringstransformen och av möjligheten till exakt placering av den valda punkten på bladbladet. Med sådan bildjustering utfördes affintransformen med hjälp av funktionen fitgeotrans som ingår i Bildbehandlingsverktygslådan. Denna omvandling har begränsats till’ likhetsversionen ’ (som endast består av översättning, rotation och likhet) eftersom scenen i PAM-fluorometern verkade inte lutad. Rörliga bilder matchades med den fasta bilden med funktionen imwarp. Grafisk illustration av registreringsalgoritmen ingår i Fig. 4.
blockschemat för Affin och valfri B-spline-registrering tillämpas på fluorescens PAM-bilder. \(\left\——vektorn av kontrollpunkter i den fasta bilden, \(\left^{\left( K \right)}\)-vektorn av kontrollpunkter i k-TH rörlig bild, \(\left^{{\left ({k^{\prime } } \ right)}}\— – vektorn av kontrollpunkter i k-TH rörlig bild efter B-spline registrering
blad i olika infektionsstadier kan ha en yta lokalt böljad eller skrynklig som i regionen markerad i analyserade Pam-fluorometerbilder (Fig. 5a, b), vilken form kan potentiellt påverka den korrekta analysen av patogenutbredningsfenomenet. Det betyder att den affina registreringsmetoden baserad på geometrisk transformation kanske inte är tillräcklig för att matcha fluorescens PAM-bilder i vissa fall av löv med uppenbarligen synlig icke-linjär deformation. Därför föreslår författarna en tvåstegsregistreringsmetod där Affin styv registrering följs av B-spline-registrering som minskar icke-linjära deformationer.
exempel på affine-och B-spline-registreringar för C3 common ice plant leaf image. a y (NO) – bilden efter Pam-förvärv, b bilden efter styv affintransformation med pilarna som representerar interaktivt inställda förskjutningsvektorer som används i andra registreringssteget och C slutlig form efter kontrollpunktbaserad B-spline-registrering
valet av icke-styv Registreringstyp utnyttjar det faktum att vanliga isväxtblad representerar lite flexibelt material och små böjkrafter håller jämna förändringar i en bladytprofil. Specificiteten för denna registreringsmodifiering är att vektorerna för bilddeformationsfältet måste införas interaktivt. För detta ändamål fästes en dedikerad vektorfältredigerare till algoritmen. Endast få förskjutningsvektorer i den rörliga bilden måste anges för att registrera lokala och släta deformationer av en bladyta som i Fig. 5B.
B-spline Rueckert-algoritmen valdes för det andra steget i registreringen. Dess implementering finns i Matlab Central File Exchange som Dirk-Jan Kroon Spline Registration Toolbox .
B-spline-registreringsproceduren består av två grundläggande steg:
-
initiering av ett rutnät G av bildpunkter jämnt fördelade över bildytan med alla deformationsfältvektorer inställda på noll och beräknar sedan ett tätt vektorfält T av deformationer i rutnätet G genom kubisk B-spline-interpolering av manuellt inställda kontrollpunktsförskjutningsvektorer \(\left^{\left (k \right)}\). Både rutnätet och det tillhörande transformeringsfältet t förfinas sedan iterativt i 4 steg för att minska rutnätets nodavstånd. Transformationen T bereds av funktionen point_registration från Spline Registration Toolbox.
-
B-spline-omvandling av alla pixelpositioner och bi-kubiska interpoleringar av färgkomponenter i den rörliga (affinregistrerade) bilden \(I_{m}\) enligt det spline-utjämnade deformationsfältet.
bildregistreringsnoggrannhet
noggrannheten för den föreslagna bildjusteringen utfördes av root mean square (RMS) på avvikelser av N = 15 kontrollpunkter som visas i Fig. 3. Förskjutningen av varje fast bildkontrollpunkt \(P_{i}\) utvärderad i en rörlig bild för fallet med och utan justeringen illustrerades i Fig. 6 som vektorerna \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\) respektive \(Q_{i} P_{i} =\Delta q_{i}\). RMS-förskjutningsfelen för alla kontrollpunkter i en enda bild för de två fallen uttrycks i Eq. (1) som \(\Delta r_{\text{rms}}\) och \(\Delta q_{\text{rms}}\).
Illustration av felbedömningen vid affine-registrering av PAM-bilder. \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots ,N\)—kontrollpunkt i den fasta bilden \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—kartläggning av kontrollpunkten \(P_{i}\) i den rörliga bilden \(I_{m}\), \(R_{i}\)—kartläggning av kontrollpunkten \(P_{\text{i}}\) efter registrering, \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\)—förskjutningsfel för kontrollpunkten \(p_{\text{i}}\) efter registrering
procentandelen restförskjutning \(\delta_{rms}\) efter Affin typregistrering kan utvärderas per en bild enligt Eq. (2).
De utvärderade affinregistreringsfelen listas i Tabell 1. De ursprungliga förskjutningarna\(\Delta q_ {\text{rms}}\) som varierar från 3,01 till 7,09 mm reduceras efter ’likhetsregistreringen’ till intervallet från 0,45 till 1,71 mm av\(\Delta r_ {\text{rms}}\) för den testade C3-anläggningen. Samma parametrar för CAM plant är \(1.90\div 5.69\; {\text{mm}}\) för \(\Delta q_ {\text{rms}}\) och \(0.41\div 1.53\; {\text{mm}}\) för \(\Delta r_ {\text{rms}}\). När \(\delta_{rms}\) är i genomsnitt både för C3-och CAM-bildserier, motsvarar den cirka 21% respektive 23%. Värdena för fluorescensparametrarna Y (NO), Fv/Fm och NPQ erhållna från isväxtbladbilder utan registrering hämtas från inkompatibla delar av bladet och kan inte beaktas (se ytterligare Fil 2).
för ytterligare B-spline registrering kartläggning transformera felet definieras av två komponenter. Den första av dem är postregistreringsförskjutningen \(\Delta r_{i} = R_{i} P_{i}\) som visas i Fig. 7a, med\ (r_{i}\) utvärderad i Eq. (3) som centroid \(\bar{p}\) i regionen \(a_{i}\).
där \(I_{R} \left (p \right) \in\ left\) anger intensiteten för den registrerade kontrollpunktsbilden vid pixeln p, \(\left| {A_{i}}\right|\)—det suddiga området. Felet andra komponenten definieras av standardavvikelsen radie \(\rho_{i}\) av intensitet spridda runt varje kontrollpunkt\ (R_{i}\) som beskrivs i Eq. (4).
där\ (\left \|\ cdot\ right\|\) betecknar den euklidiska normen för vektorn mellan punkterna p och \(\bar{p}\) i bildplanet. Suddning av den inriktade kontrollpunkten \(R_{i}\) visas på grund av det faktum att den olinjära registreringen använder bicubisk interpolering i det finita upplösningsnätet G. denna effekt mättes experimentellt genom att utföra en given B-spline-transformation i bilden byggd från Vita kontrollpunkter på svart bakgrund. Tabell 2 innehåller magnituderna \(\Delta q_{i}\) av N = 9 exempel förskjutningsfältvektorer som visas i Fig. 5b. Magnituderna \(\Delta r_{i}\) för vektormappningsfelen efter spline-registrering mäts mellan de önskade fasta kontrollpunkterna \(P_{i}\) och centroiderna för registrerade punkter \(R_{i}\) utvärderade i regionen \(a_{i}\). Alla testade \(\Delta r_{i}\) värden är under pixelupplösningen lika med \(50\;\upmu{\text{m}}\) och kan försummas—avrundas till 0. Detta innebär exakt positionering av kontrollpunkter genom spline transform. Standardavvikelsen \(\rho_{i}\) för suddig region som visas i Tabell 2 efter fördubbling kan vara ett mått på kontrollpunktens suddighet. Sedan varierar det ungefär från \(24\;{\text{till}}\;63\;\upmu{\text{m}}\) vad motsvarar en pixeloskärpa. Således tillåter denna transformation att lokalt återställa den korrekta formen av y (NO) förändringar i en fluorescensbild.
förklaring av felet i B-spline bildregistrering av PAM-bilder. a felmatchning av kontrollpunktsplatsmappning under registrering, b bildintensitetsfördelning av spline-registrerad kontrollpunkt, \(p_{i} ,\;i = 1, \ldots ,N\)—kontrollpunkt i den fasta bilden \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—motsvarande kontrollpunkt \(P_{i}\) i den rörliga bilden \(I_{m}\), \(R_{i}\)—kartläggning av kontrollpunkten \(p_{i}\) efter registrering, \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\)—förskjutningsfel mått på Kartläggning av kontrollpunkten \(p_{i}\), \(a_{i}\)—suddig region runt \(R_{I}\) som motsvarar kontrollpunkten \(p_{i}\), \(\rho_{i}\)—standardavvikelsen radie av \(R_{i}\) oskärpa
mätningen av stressutbredning
dataanalysen tillämpar ett speciellt redigeringsverktyg för att manipulera en stapel PAM-bilder efter registreringen. Huvudredigeringsfunktionen gör det möjligt att rita två datainsamlingslinjesektioner \(L_{1} \;{\text{och}}\;L_{2}\) med samma längd (Fig. 8), som kan observeras och finns på vilken bild som helst från stapeln. I det övervägda experimentet börjar den första raden \(L_{1}\) vid inokuleringsstället \(s_{1}\), där stressfaktorn appliceras på bladvävnaden vid tiden t, och bör ungefär ställas in i riktning mot spänningsutvidgning. Den andra raden \(l_{2}\) placeras längs midrib där den observerade stresspåverkan i tid alltid var begränsad och fluorescensparametrar uppvisar minimala förändringar. Linjerna ska passa helt i bildens sammanhang.
Mätregioner I y (NO) bilder av vanliga isväxter lämnar efter datorns inriktning. Mätpunkterna indikerar: (1) mesofyll vid ympningsstället, (2) mesofyll utan skada, (3) midrib nära ympningsstället. Mätlinjen (L1) är orienterad i riktning mot spänningsutbredning inom mesofyll och linjen (L2) ligger längs midriben. Linjer startade vid punkterna (S1) respektive (S2)
ytterligare alternativ för punktvis mätning är möjligt där tre små olika cirkulära regioner med 10 pixelradie placeras interaktivt i synfältet (Fig. 8). De bör tillhöra bladregionerna med olika fluorescensparametrar med tiden. Alla registrerade pixelvärden är i genomsnitt inom dessa regioner.