Rollen av chordin / BMP-signaler i däggdjurs faryngeal utveckling och DiGeorge syndrom / utveckling

resultat

Gastrulationsfel i Chrd-/- möss

Chrd utsöndrat Bmp-bindande protein uttrycks i musnoden ochdess derivat, notokord och faryngeal endoderm(Fig. 1A-F). Chrd-proteinet innehåller fyra cysteinrika(CR) domäner, som alla kan binda BMP.CR1 och CR3 visar den högsta affiniteten för Bmp4 och kan motverka BMP-signalerpå mRNA-injektion i Xenopus-embryon (Larrain et al., 2000). För att generera en null-allel av Chrd, förberedde vi en inriktningskonstruktion med översättningsstoppkodoner i de tre möjliga läsramarna inom signalpeptidregionen. Stoppkodonerna följdes av en ramförskjutning och införandet, efter CR1, av IRES-lacZ-och PGK-neo-kassetter som ytterligare förstörde Chrd-genen (Fig.1G). Transkript från denna Chrdtm1DR-allel (hädanefter kallad Chrd-) var odetekterbara inChrd – / – embryon vid nodstadiet (Fig. 1J, pilspets).

heterozygota chrd-möss var livskraftiga och bördiga och parades tillgenerera Chrd – / – embryon av olika utvecklings stages.At dag E8. 5 observerade vi närvaron av resorptionsknutor i livmodern avgravida kvinnor och en liten minskning av det förväntade antaletchrd-/- embryon (50 återhämtade, 57 förväntade). Fourgenotyped homozygota mutanta embryon visade en tydlig minskning av storleken på den embryonala regionen, åtföljd av en utvidgning av allantois medrespekt för resten av embryot (Fig.2A, A’). I histologiska sektioner, en avsevärd hypoplasiav nervplattan (Fig.2B, B’), frånvaro av somiter och notokord(Fig. 2C, C’) och anabundance av extra-embryonala mesodermala celler i allantois(Fig. 2D, D’) observerades. Resten av mutanterna (46) var morfologiskt oskiljbarafrån deras heterozygota och vilda kullkamrater. Fenotypen av de fourabnormala mutanterna liknade, men mindre uttalad än, ventraliseringen av mesodermen observerad i dubbel homozygot Chrd;Nogmutanter (Bachiller et al., 2000) där dessutom främre trunkationer av neuralplattan också var närvarande.

i zebrafisk och Xenopus orsakar inaktivering av Chrd anexpansion av ventral mesoderm och reduktion av dorsal mesoderm och neuralplate (Schulte-merker et al.,1997). Hos däggdjur bildas mesodermen under gastrulation genomintryck av epiblastceller genom den primitiva strimman. Celler som går ut vidden bakre änden av den primitiva strimman rör sig in i den extra-embryonala regionendär de ger upphov till en mesodermal härstamning (allantois, amnion och blodöar i äggula sac) motsvarande den ventrala mesodermen avxenopus. Däremot förblir celler som ligger i mer främre regioner avstreak inuti embryot korrekt och producerar den paraxiala, mellanliggande och laterala plattan mesoderm av den framtida stammen. Den tidiga fenotypen avchrd – / – mutanter, där allantois expanderas vid utgiften av den embryonala mesodermen, överensstämmer med en tidig ventralisering av musembryot. Denna fenotyp måste leda till döden av de drabbadedjur, eftersom ingen homozygot mutant med onormal allantois återhämtades fråndissektioner vid senare skeden. Analys av denna fenotyp med molekylära markeringarutfördes inte eftersom så få onormala embryon erhölls.

Perinatal dödlighet

endast 49% (95 av 194) av de förväntade Chrd-/-djuren återfanns vid födseln, alla visar samma fullständigt penetrantfenotyp. Av dessa var majoriteten dödfödd,men några försökte utan framgång att blåsa upp sina lungor. Externt, homozygot mutant neonatvar något mindre än deras vildtyp kullkamrater och visade cyanos,mikrocefali och reduktion av det yttre örat, vilket sattes onormalt näratill ögat (Fig. 3A’).Histologisk undersökning (Fig.3B ’- C’) avslöjade bristen på tymus (t, ett derivatav den tredje svalgpåsen) och sekundär gom (p) och hypoplasi avinre örat (ie) i mutanterna. Den främre loben och pars intermedia avpituitary körtel (pi), båda härledda från dorsal oral ectoderm omedelbartintill den främre endodermens cefaliska gräns, var normala(Fig. 3C, C’). Detta definierade rostralgränsen för fenotypen i orofarynx, medmalformationer begränsade till derivat av Chrd-uttrycksendoderm. Sköldkörteln, som bildas i ventral pharyngeal endoderm vid theforamen caecum, differentierade men var hypoplastisk och av oregelbunden form(TH, Fig. 3C’). Deparathyroidkörtlar, derivat av svalgpåsar 3 och 4, var frånvarande(data visas inte), en observation som överensstämmer med den neonatala hypokalcemiasenen hos individer med DiGeorge syndrom(DiGeorge, 1968). Vi slutaatt fenotypen av Chrd – / – dödfödda möss rekapitulaterde flesta av de egenskaper som beskrivs hos sådana individer.

Skelettdefekter

i skelettpreparat av Chrd-/- nyfödda djur var appendikulära och ländryggsben normala,men basen på skallen ochDet främre axiella skelettet presenterade flera defekter. Förändringar itemporal ben inkluderade brist på squama temporalis (st) och förkortning av den zygomatiska bågen (Fig.4A, A’). Vi observerade också en avsevärd hypoplasi avhyoidben och av sköldkörteln och cricoid laryngeal brosk(Fig. 4B’), och anabnormalt liten käke (Fig.4C’). I basen av skallen verkade alisphenoid (as)normalt, men i mittlinjen smältes basioccipital (bo) och basisphenoid(bs) ben och presphenoid (ps) var hypoplastisk(Fig. 4D, D’). Konsekvent med de histologiska fynden misslyckades palatinhyllorna att sträcka sig medialt för att bilda den sekundära gommen. I örat, den tympaniska ringen och otiska kapselnreducerades och missbildades (Fig.4D’). Skelettmissbildningar observerades också i livmoderhalsenoch bröstkorgsregioner i ryggraden. Vertebrala kroppar(vb) varmindre hos Chrd-/- nyfödda (Fig. 4e’), med fördröjningossifiering och tillfällig förlust av andra delar av ryggkotorna somspinösa processer, neurala bågar och atlasens främre båge(Fig. 4E ’ andFig. 5A’).

skelettdefekterna hos Chrd-mutanter var redan detekterbara inbrottskondensationer vid E14 .5 (Fig.5A, A’). Den basioccipital och basisphenoid brosk werefused, och benbildning centrum av basioccipital var smalare ochextended in i basisphenoid (Fig.5B, B’). Den främre notokordet, som var närvarande imittlinje av vildtypen basioccipital, var frånvarande i Chrd-mutanter(Fig. 5B, B’). Frånvaron av främre notokord bekräftades genom histologisk undersökning avcervikal region vid E14 .5 (Fig.5F’).

benen som påverkas av Chrd-mutationen har mycket olikaursprung. De basioccipital är rent av somitiskt ursprung; delar av thebasisphenoid uppstår från endokondral ossifiering av cephalic mesenchym; thepalatin härstammar från intramembranös ossifiering av neural crest-derivedmesenchyme; otic-kapslarna skiljer sig från en blandning av paraxiala mesodermand neurala crestceller; och hyoid är strikt neural crest härledd(Le Douarin och Kalcheim,1999). Mitt i en sådan mångfald av linjer verkar den förenande principen om fenotypen vara placeringen av missbildade strukturer i närheten av den Chrd-Uttryckande axiella mesendodermen(Fig. 1E). Denna tolkningär förenlig med den observerade för tidiga degenerationen av anteriornotokordet hos Chrd-/- djur och med kravet påprekordala plattan och mesendoderm härledda signaler för utveckling avskelett av huvudet (Belo et al.,1998; Couly et al., 2002; David et al.,2002).

DiGeorge-liknande kardiovaskulära defekter

den cyanos som observeras vid födseln kan vara ett tecken på hjärtfel. För att undersöka detta ytterligare utfördes dissektioner vid olika stadier av embryoniskutveckling. Vid E14.5, hjärtan avchrd – / – djur visade ett enda kärl, istället förnormala två, i hjärtutflödeskanalen (Fig. 5D, D’, E, E’).Detta tillstånd är känt hos människor som ihållande truncus arteriosus och är enviktig missbildning hos individer med DiGeorge syndrom. Bristen påseparation mellan den stigande aortan och lungstammen kan öka den högra ventrikelns arbetsbelastning som orsakar hypertrofi, såväl som vasodilatation, ödem och blödning som ses i E14.5 embryon(Fig. 5C’). Som inDiGeorge syndrom, defekter i det kardiovaskulära systemet sträckte sig bortom utflödeskanalen och inkluderade de stora kärlen som härrör från faryngeal archarteries (Fig. 6). Hos nyföddakrd-mutanter anslöt sig de vanliga halspulsåderna direkt till truncusarteriosus, vilket resulterade i frånvaro av den brakiocefaliska artären och en del avortabågen (Fig. 6A-C).Lungartärerna härstammar direkt från den proximala truncusarteriosus, vilket resulterar i frånvaro av en gemensam lungstam(Fig. 6A-C). Dessutom observerades lateralitetsdefekter, med en onormal högervridning av aortain 40% av mutanterna (Fig. 6, jämför 6med 6F). När dissektioner utfördes från baksidan, detkunde se att, beroende på lateraliteten hos den nedåtgående aortan, denhöger eller vänster subklaviska artärer antog en onormal retroesofagealposition (Fig. 6D-F). Liknande defekter har beskrivits i kycklingembryon med ablationer av neurala vapenceller(Kirby et al., 1983), och inmice som bär raderingar i DiGeorge congenic region(Lindsay et al., 1999; Merscher et al., 2001) ormutationer i Tbx1 och Fgf8(Abu-issa et al., 2002; Frank et al., 2002; Jerome och Papaioannou, 2001; Lindsay et al., 2001; Vitelli et al., 2002b).

vid födseln var endast 49% av de förväntade chrd-homozygota mutanternaåterhämtas. 48 av de förväntade 56 (86%) Chrd-/-embryona levde dock fortfarande i kullar dissekerade vid E14.5, en frekvens som inte var signifikant annorlunda än den som observerades vid E8.5 (88%). Den kraftiga ökningeni dödlighet efter E14.5 sammanfaller med den fullständiga manifestationen avkardiovaskulär fenotyp, och föreslår att cirkulationsfel är enviktig orsak till dödlighet hos Chrd-/- embryon undersen graviditet.

faryngeala abnormiteter

för att bestämma uppkomsten av faryngeal fenotypen dissekerade vi gravidkvinnor från heterozygota matningar vid olika tidpunkter efter coitum. Vid E9.0, astage vid vilken Chrd uttrycks i faryngeal endoderm,Chrd-/- embryon kan identifieras genom en indragning ihalsregionen (Fig.7A’, pil). Mutanternas otiska vesiklar reduceradestill hälften av sin normala diameter (Fig.7A’, pilspetsar) och den andra (hyoid) svalgbågen varsaknar. Faryngealbågar tre till sex bildades aldrig i mutanta embryon(Fig. 7B ’ och data som inte visas). De saknade eller missbildade strukturerna är antingen direkta föregångare ellerspela induktiva roller under utvecklingen av många av de organ som ärdefektiva vid födseln hos Chrd-/- möss. Eftersom de flesta avfenotypiska abnormiteter som observerats hos nyfödda mutanter har sina embryologiskaursprung i faryngeal endoderm och peripharyngeal region, analyserade viuttrycket av ett antal gener som är kända för att ha viktiga utvecklingarroller i mänsklig ärftlig sjukdom.

vi undersökte först uttrycket av Pax3, en transkriptionsfaktorexpressed i neural crest, dorsal neural tube och somites(Goulding et al., 1991). Inhumans, PAX3 muteras i neurala vapensjukdomar betecknawaardenburg syndrom typ 1 och 3(Strachan och Read, 1994) ochär en samregulator, tillsammans med SOX10, av mikroftalmia orMITF-genen (Bondurand et al., 2000), transkriptionsfaktorn muterad i Waardenburg syndromtyp 2a hos människor (Tassabehji et al.,1994). Mutation av Pax3 i splotch (Sp2H) – musen resulterar i hjärtfel, inklusivepersistent truncus arteriosus, liksom missbildning av tymus, sköldkörteloch paratyroidkörtlar (Conway et al.,1997). Vi fann att PAX3-uttrycket varskiljbar mellan mutanta och vilda embryon vid E7.5 (ej visad),men vid E10.5 observerades signifikanta skillnader. PAX3-positiveneural crest celler som migrerar genom svalgbågar 3, 4 och 6 (Fig. 7C, pilspetsar) var knappt detekterbara hos Chrd – / – djur (Fig. 7C’). Dessa neuralkrestceller befolkar septum som separerar aortan från lungartäreni utflödeskanalen, eller konotruncal region, i hjärtat(Li et al., 2000). Misslyckandet av hjärtneural crest för att nå hjärtat förklarar bristen på utflödestraktseptation och den efterföljande kardiovaskulära fenotypen observerad ichrd mutanter. Intressant är att uttrycket av Pax3 i andra vävnader som den mandibulära (md) komponenten i den första faryngealbågen, dermomyotomer(dm) och myoblastprekursorer i frambenen (fl) inte påverkades(Fig. 7C’).

därefter utförde vi in situ hybridiseringar med Sox10, en genemuterad hos individer med Waardenburgs syndrom typ 4(Pingault et al., 1998) detuttrycks i neurala vapen och Schwann-celler. Vid E7. 5 var uttrycket avsox10 detsamma i Chrd-/- embryon och i deras vildtypskatter (data visas inte). Vid E9.5 Var Sox10uttryck i ryggrotsganglierna (drg) på stammen normal(Fig. 7B, B’), men fördelningen av gliaceller som uttrycker Sox10 avslöjade specifikadefekter i organisationen av det perifera nervsystemet i nacken ochhuvudregionen hos mutanterna (Fig.7B’). I synnerhet visade kraniala sensoriska ganglier markeradeonormaliteter. Trigeminala (tr) och vestibulo-cochlear (vc) ganglier,motsvarande V-och VIII – kranialnerven, var lokaliseradenärmare tillsammans i Chrd-/ – embryon än i vildtyplittermates. Dessutom sågs onormala nervprojektioner som förbinder de två avdem (Fig. 7B’, pilspets). Geniculate (g), petrosal (p) och nodos (n) ganglier,motsvarande kranialnerver VII, IX och X, var de mest drabbade, visandeantingen en extrem minskning i storlek eller fullständig frånvaro. Dessa tre gangliaursprung från epibranchial placoder, och är kända för att kräva induktivesignals från anterior endoderm för deras rätta utveckling(Begbie et al., 1999). Bristen på epibranchial placod-härledda ganglier indikerar att det utsöndrade proteinChrd krävs för aktiviteten hos den induktiva signalen som frigörs avfaryngeal endoderm.

Pax9 är en transkriptionsfaktor som krävs för utvecklingen av thepharyngeal endoderm och dess derivat i musen(Peters och Balling, 1999;Peters et al., 1998). Vid E9.5, uttryck av Pax9 i faryngeal endoderm ofChrd-/- embryon var svagare än i deras vildtypelittermates (pe, Fig.7D, D’). Pax9-uttryck avslöjade att storleken ochformen av struphuvudet förändrades i Chrd-mutanterna, med faryngealpouches reducerade till en enda svullnad i den främre delen(Fig. 7E, E’). Denhypoplasi i struphuvudet bekräftades av histologiska sektioner av E14.5embryos, i vilka den främre endodermen uppträdde som ett tunt rör som skisserade agreatly minskad lumen (ph, Fig.5F, F’). Minskningen av faryngeal endoderm har också varit observerad i Xenopus Chrd knockdowns(Oelgeschl Baccarat et al.,2003). Icke-faryngeala regioner där Pax9 mRNA ärnormalt uttryckt, såsom de somitiska sklerotomerna(sc) och ansiktsmesenkym (fm), visade inte skillnader i fördelningen eller överflödet avtranskript (Fig.7F, F’).

vi drar slutsatsen från dessa studier att förändringar i PAX3, Sox10 ochpax9-uttryck är begränsade till ett mycket begränsat område av widerexpressionsdomäner, vilket tyder på att brist på det utsöndrade proteinet Chrdspecifikt stör lokala regleringsvägar som verkar i peripharyngealregionen kring Chrd-Uttryckande endoderm.

tbx1 och fgf8-uttryck kräver chordin

för att studera interaktionen mellan Chrd och gener som är kända för att orsakadigeorge eller DiGeorge-liknande fenotyper hos möss analyserade vi uttrycket avtbx1 och Fgf8 i Chrd-mutanta embryon. Tbx1är medlem i T-box-familjen av transkriptionsfaktorer(Papaioannou och Silver,1998). Den kartlägger inom DGS/VCFS 22q11 mikrodeletion hos människor och har nyligen visat sig orsaka DiGeorge-liknande fenotyp vid inaktiveringi möss (Jerome och Papaioannou,2001; Lindsay et al.,2001; Merscher et al.,2001; Vitelli et al., 2002a). Uttrycket av Tbx1 ändrades ikrd – / – embryon. I vildtyp E7.5 djur, tbx1uttrycks i foregut (framtida faryngeal endoderm) och huvud mesoderm(Fig. 8A). I detta skede visade mutanta kullkamrater en tydlig minskning av nivåerna av Tbx1expression i samma områden (Fig.8A’). Minskningen i tbx1-mRNA var lika klari faryngeområdet hos Chrd-homozygota embryon vid E8.0, E8.5 oche9.0 (Fig.8B’, C’, D’). Tvärgående histologiska sektionervisade att på cellulär nivå överflöd av tbx1 transkriptreducerades drastiskt i endoderm, både i struphuvudet och föregut upp tillnivå av leverdivertikulum (Fig.8F-H’) minskning av koncentrationen av tbx1 mrnavar också tydlig i mesoderm, inklusive huvud, splanchnic (pilhuvud) ochsomatisk mesoderm(pilar) i peripharyngeal regionen (Fig.8F’, G’, H’). Dessutom var Tbx1uttryck vid E9 i den mesodermala kärnan i den första faryngealbågen diffus, sträcker sig till det mesta av bågen, och tbx1-transkriptioner varfrånvarande från den otiska vesikeln (Fig.8D-D’).

Fgf8 är en utsöndrad tillväxtfaktor uttryckt i en mängd olikavävnader, inklusive faryngeal endoderm och angränsande mesoderm(Crossley och Martin, 1995;MacArthur et al., 1995).Under tidig utveckling krävs Fgf8 för gastrulation(Sun et al., 1999) och etablering av vänster/höger symmetriaxel(Meyers och Martin, 1999). Atlater stadier av Fgf8 krävs för lem (Lewandoski et al., 2000; månen och Capecchi, 2000) andcraniofacial (Trump et al., 1999) utveckling. Nya experiment har visat att möss medreducerad fgf8-aktivitet uppvisar ett spektrum av kardiovaskulära ochfaryngeala defekter som nära efterliknar DiGeorge syndrom(Abu-issa et al., 2002; Frank et al., 2002). Dessutom avskaffas fgf8-uttrycket i faryngeal endoderm ofTbx1 – / – mutanter och båda generna interagerar genetiskt underdifferentieringen av faryngeal arch arteries(Vitelli et al., 2002b). AtE9, Fgf8-uttryck i Chrd-mutanter är normalt imid-hindbrain isthmus, frontonasal framträdande och svans. I pharyngealendoderm reduceras emellertid fgf8-transkriptnivåerna drastiskt (Fig. 8E’). Reduktionen av tbx1-och Fgf8-uttryck i Chrd – / – embryon föreslog att båda generna verkar nedströms Chrd i samma regleringsväg. Dessa experiment bestämmer inte Om Chrdis krävs för underhåll eller för induktion av Tbx1 ochfgf8 i struphuvudet och närliggande vävnader.

för att testa om Chrd kan inducera Tbx1 och Fgf8 injicerade vi Chrd mRNA (50 pg) i den ventrala regionen avxenopusembryon vid fyrcellssteget. Ventral marginalzon (VMZ)explanter dissekerades tidigt gastrula, odlades tills syskonembryon nådde tidigt neurula-Stadium och analyserades av RTPCR. Tbx1 ochfgf8 mRNA uttrycktes vid höga nivåer i hela embryon och dorsalmarginal zon (DMZ) explants i detta skede, och vid låga nivåer i VMZ explants(Fig. 8i, körfält 1-3). Uponmicroinjection, chrd mRNA ökade nivåerna av Tbx1 ochfgf8 i VMZ (Fig. 8i, körfält 4). In situ hybridisering av Mikroinjekterade Xenopus-embryonbekräftade att tbx1-transkripten inducerade av Chrd mrnavar belägna i faryngeal endoderm (data visas inte). Vi drar slutsatsen attchrd, en BMP-antagonist, kan inducera Tbx1-och Fgf8-uttryck i Xenopusembryon och krävs för fullständigt uttryck av dessa gener i musembryos faryngeala region.