kromatin Immunoprecipitation (ChIP) analys är en viktig metod för transkriptionell reglering övervakning med avslöjad kunskap om interaktioner mellan specifika proteiner och en genomisk DNA-region. Med tanke på det faktum att DNA-bindande proteiner (inklusive transkriptionsfaktorer och histoner) i levande celler kan vara tvärbundna med det DNA som de är bindande, används ChIP för att immunoprecipitera protein-DNA–komplexet ur cellulära lysater med en lämplig antikropp. De immunoprecipiterade komplexen samlas in genom centrifugering och proteiner elueras för vidare analys såsom western blot och LC/MS.Nukleinsyraanalys uppnås genom PCR, RT-PCR, cDNA-sekvensering och mikroarray. Detta protokoll ger en detaljerad procedur för att uppnå framgångsrik Chipanalys på ett snabbt och effektivt sätt.
reagenser:
- 37% formaldehyd
- 1 m glycin
- celllysbuffert: 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7, 5), 5 mM EDTA, 0, 5% NP-40, 1% Triton X-100, med 1 kg proteashämmare cocktail.
- PBS: pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4.
- 10% Chelex 100
Equipments:
- Sonicator
- Ultrasonic bath
- Rocking or shaking device
- Eppendorf tube rotator
- Refrigerated microcentrifuge
- Gel electrophoresis apparatus
- PCR apparatus
Steps:
Cross-link and cell collection
1. Tillsätt 27 oc 37% formaldehyd per 1 mL odlingsmedium för att erhålla en slutlig koncentration vid 1%, inkubera cellerna i 10 minuter vid rumstemperatur medan du långsamt skakar på en gungnings-eller skakningsanordning.
2. Släck tvärbindning genom att tillsätta 141 oc 1 m glycin per 1 mL odlingsmedium för att erhålla en slutlig koncentration vid 125 mM, inkubera cellerna i 5 min vid rumstemperatur.
3. För flytande celler: spännhylsceller i ett 15 mL koniskt rör, Centrifugera vid 2,000 xnumx CG vid 4 xnumx C i 5 min. Kassera supernatanten och tvätta cellerna två gånger med kalla PBS.
Hoppa till steg 5.
4. För limceller: ta bort mediet, tvätta cellerna två gånger med kalla PBS. Skrapa cellerna i PBS i ett 15 mL koniskt rör, Centrifugera vid 2,000 xnumx CG vid 4 xnumx C i 5 min.
Lys och ultraljudsbehandling
5. Kassera supernatanten, tillsätt 1 mL kallcellslysbuffert per 1 msk 107 celler. Omsuspendera pelleten genom att pipettera upp och ner flera gånger och inkubera på IS i 10 minuter.
6. Sonicate att skära kromatinet i 0,5~1 kb fragment. Undvik skum och håll provet på is.
anmärkningar:
- ultraljudsbehandling villkor bör optimeras beror på provet och sonicator modell. Vanligtvis har sex 15-sek pulser följt av 45-sek viloperioder vid utgång 6.0 visat sig fungera. För analys fragmentet storlek, extrahera en liten volym av totalt DNA från en alikvot av klippt kromatin, och sedan analysera på en agaros gel (1~2%).
- volymerna föreslås vara 1 ml för att upprätthålla ultraljudsbehandling effektivitet.
7. Centrifugera vid 12,000 xnumx kg vid 4 xnumx xnumx C i 10 min och behåll supernatanten.
8. Överför 0,5 mL supernatant till en färsk 1.5 mL rör för DNA-fragmentanalys.
Immunutfällning
9. Lägg till relevanta antikroppar eller normal IgG till provet och inkubera i 15 minuter i ett ultraljudsvattenbad vid rumstemperatur.
anmärkningar:
- Välj IgG från samma art där antikropparna producerades.
- inkubationstiden bör optimeras beroende på antikroppen och antigenet. För antigener med låg expressionsnivå kunde inkubationen utföras vid 4 c c över natten på en roterande plattform .
10. Förbered Protein A-agarospärlor: tvätta pärlorna tre gånger med 1 mL lysbuffert (utan proteashämmare), Centrifugera vid 2000 kg i några sekunder vid 4 kg C och kassera sedan supernatanten.
11. Späd pärlorna 1: 1 med lysbuffert och tillsätt 50 ukyl till provet.
12. Inkubera vid 4 C i 30~45 min i en roterande plattform.
13. Centrifugera vid 2000 kg i 1 min vid 4 kg och kassera sedan supernatanten.
14. Tvätta pärlorna i fyra gånger med 1 mL lysbuffert (utan proteashämmare), kassera supernatanten.
DNA-rening och analys
15. Resuspendera de tvättade pärlorna med 100 millil 10% Chelex 100.
16. Pipettera upp och ner i flera sekunder och koka sedan provet i 10 minuter.
17. Centrifugera vid 12 000 kg i 1 min vid rumstemperatur och överför supernatanten till ett nytt 1,5 mL rör.
18. Rena DNA med hjälp av ett DNA-reningssats eller med standardfenol: kloroform extraktionsprotokoll.
19. Lös upp DNA med 50 UCL ddH2O och använd 2~10 UCL av DNA-provet (25% av reaktionsvolymen) i PCR-reaktionerna
lär dig om principen om ChIP
nå till vårt ChIP servise
om du har några frågor, vänligen kontakta oss på: