mikroskopi är som standard en teknik som gör att vi kan observera, snarare än att mäta, biologiska händelser och dra slutsatser utifrån vad vi ser, snarare än baserat på vissa beräkningar. Ämnet i denna artikel kan därför verka lite överraskande eftersom det handlar om mätningarna av kolokalisering. Medan det finns situationer där du kan bestämma proteinkolokalisering visuellt, är det ofta nödvändigt med en mer exakt bekräftelse på en ömsesidig fördelning av två sonder.
Varför är en visuell bestämning av Kolokalisering otillräcklig?
endast om du har samlat in bilder efter ett kontrollerat protokoll för kolocaliseringsanalys (tillräcklig signal i varje kanal, ingen autofluorescens eller signalblödning) är det säkert att säga att de två proberna colocalize enbart baserat på observation. I det här fallet, om den gröna signalen colocalizes med den röda signalen och bilden är mestadels gul, behövs ingen statistisk mätning. Men om du inte ser en överlappning betyder det inte att det inte finns där! Det kan vara så att intensiteterna för de två kanalerna inte är desamma. Namnlösa: den mellanliggande färgen som vi ser Kan bara visas om båda sonderna har samma intensitet. Därför kan slutsatser baserade på visuell bestämning ofta leda till falska negativa resultat.
vilka metoder för Överlappsmätning finns?
även om det inte finns någon standardinriktning i denna fråga finns det två metoder som används allmänt och allmänt accepterade. Dessa involverar antingen Pearsons korrelationskoefficient (PCC) eller Manders kolokaliseringskoefficient (MCC).
dessa två metoder relaterar till två olika aspekter av kolokalisering – korrelation och samtidig förekomst. Pearsons koefficient är relaterad till korrelationen mellan pixelintensiteterna i de två kanalerna. Den mäter förhållandet mellan signaler – oavsett om signalvärdena i en kanal stiger samtidigt med den andra, eller om en signal faller när den andra stiger. Korrelation skiljer sig från samtidig förekomst, vilket matematiskt uttrycks genom Manders koefficient. Detta representerar täckningen av en signal över den andra, vilket avslöjar i vilken utsträckning två sonder upptar samma plats. Låt oss utforska detta lite längre.
Pearsons korrelationskoefficient (PCC)
Definition: PCC återspeglar det linjära förhållandet mellan signalintensiteter. Värdena kan variera mellan 1 (perfekt positiv korrelation) och -1 (perfekt negativ korrelation), medan 0 betyder att det inte finns någon korrelation. Det är möjligt att utforska PCC visuellt genom ett scattergram där koordinaterna på tomten representerar pixelvärden (signal) i båda kanalerna. Ju fler punkter som kluster runt en rak linje, desto bättre är korrelationen mellan de två signalerna
krav: PCC bör mätas i intresseområdet (ROI) för att undvika falska positiva eller negativa. Om du mäter PCC över hela bilden kommer pixlar i bakgrunden att korrelera perfekt och blåsa upp PCC. Däremot, om mätningen utförs i en region utan intresse där det finns en heterogen fördelning av båda kanalerna, kommer PCC att vara deprimerad.
du kan välja ROI för hand eller genom tröskelvärde för att utesluta bakgrund. Oavsett hur du gör det, var försiktig, särskilt när du trösklar. Valet av ROI måste inkludera alla relevanta regioner i cellen / cellerna, dvs varje plats där en sond kan förväntas distribuera. Om du använder en intensitetsbaserad metod för att välja ROI (tröskelvärde) kan du oavsiktligt utesluta relevanta resultat. Hur kan detta hända? Du kan ha en region med ömsesidig uteslutning, där ingen etikett visas, och detta kan vara ett biologiskt relevant resultat (båda molekylerna uttrycks inte på den platsen i cellen). Tröskelvärdet kommer dock inte att inkludera denna region i avkastningen, vilket riskerar att förlora relevanta resultat.
rekommenderas för: PCC bör användas på bilder där det finns ett linjärt samband mellan intensiteter. Om data passar till en mer komplex modell kommer PCC inte att fungera bra. En annan metod bör också väljas om det finns en ojämn överlappning, där sonder samdistribuerar men i olika proportioner. Detta kan inträffa när GFP används som en sond. Dess uttrycksnivå kan skilja sig mellan celler och potentiellt orsaka depression av PCC på grund av hög intercellvariabilitet.
Manders Kolokaliseringskoefficienter
Definition: MCC är ett mått som beskriver samhändelse-fraktionen av ett protein som kolokaliserar med det andra. MCC ger dig ett bra mått på colocalization när du märker ett protein i en vesikel och vill se hur det colocalizes med en viss struktur i en cell, säger en mikrotubuli. Om vi antar att alla vesiklar colocalize med mikrotubuli men bara en andel mikrotubuli colocalizes med vesikeln, kan du beräkna MCC för varje kanal och få en metrisk som kvantitativt beskriver denna fraktionerad överlappning.
krav: fångsten med MCC är att den kräver eliminering av bakgrunden. Den svåraste delen här är att ställa in en cutoff-punkt för intensitet som möjliggör bakgrunds subtraktion. MCC mäter den fullständiga fluorescensen av en sond i varje pixel över noll. Men över noll pixlar är extremt sällsynta på grund av faktorer som: autofluorescens, ljusläckage, icke-specifik märkning eller fluorescens från out of focus image plains. Mätningen av MCC kräver därför ett noggrant urval av tröskeln (cutoff).
det första sättet att göra detta är global tröskelvärde, där du subtraherar ett tröskelvärde från varje pixel, så att varje nivå under den valda cutoff kommer att vara bakgrund och varje pixel ovan kommer att falla i en region av intresse. Även om detta är mycket intuitivt är global tröskelvärde ganska rå och kan leda till oönskade situationer som uteslutning av pixlar med lågt värde som ligger nära bakgrunden men faktiskt är positiva.
ett mer automatiskt och mindre subjektivt alternativ är Costes-metoden där tröskeln beräknas genom att beräkna PCC flera gånger. Detta tjänar till att definiera intervallet av pixelvärden som är positiva och därför inte bör uteslutas. PCC beräknas för olika grupper av pixlar, och pixelvärdena för vilka PCC är lika med eller nära noll tas som tröskelvärden. Ändå bör det också kontrolleras visuellt, eftersom det i bilder med lägre signal-brusförhållande kan identifiera en mycket låg tröskelnivå så att den inte skiljer märkta strukturer från bakgrunden.
rekommenderas för: när den biologiska frågan om ditt experiment gäller i vilken utsträckning protein/strukturer överlappar varandra, bör MCC vara måttet på valet. Dessa koefficienter tolkas mer intuitivt än PCC och är oberoende av signalproportionalitet (skillnaderna i antalet strukturer märkta av varje sond).
innan du börjar din analys
oavsett vilket val du väljer för att mäta kolokalisering är det mycket viktigt att bildsamlingen utförs på ett korrekt sätt. Försök att kontrollera så många faktorer som möjligt och förbereda en uppsättning kontrollprover som låter dig övervaka så många variabler som möjligt.
Tänk på att visuell kolocaliseringsbestämning påverkas av många faktorer, inklusive observatörens subjektivitet, det faktum att varje individs hjärnor kan se färger annorlunda, en möjlig färgblindhet hos observatören och den rumsliga upplösningen som bestämmer pixelstorleken, bland andra. Var noga med att bearbeta bilderna du ska analysera på ett enhetligt sätt och kom ihåg att all okontrollerad manipulation kan leda till att du förlorar relevant information.
och sist men inte minst
dessa beräkningar implementeras i de flesta programvarupaket för bildanalys, t.ex. ImageJ och Volocity. Men med tanke på att mätning av kolokalisering fortfarande är ett något förvirrande fält krävs förbättringar, så håll reda på de nya versionerna och paketen för programvaran.
hur mäter du colocalization? Låt oss veta genom att skriva i kommentarfältet!
litteratur:
Dunn KW, Kamocka MM, McDonald JH. En praktisk guide för att utvärdera kolokalisering i biologisk mikroskopi. American Journal of Physiology – Cell Physiology (2011), 300 (4) C723-C742
Adler, Jeremy, Parmryd, Ingela: Kolokaliseringsanalys i fluorescensmikroskopi. I: Taatjes, Douglas J., Roth, J.), Cellbildningstekniker: metoder och protokoll, New York: Humana Press, 2012, s.97-109
Mcdonald JH, Dunn KW. Statistiska tester för åtgärder för kolokalisering i biologisk mikroskopi. Journal of microscopy. 2013; 252(3): 295-302
har detta hjälpt dig? Vänligen dela med ditt nätverk.