hittills i vår plasmider 101-serie har vi arbetat oss igenom plasmidkartan: antibiotikaresistens, replikeringens ursprung och så vidare. Fram till denna punkt kan vi replikera vår plasmid och se till att celler behåller den; nästa steg är att få plasmid att uttrycka vår gen av intresse. Ange promotorn-elementet som ansvarar för att initiera transkriptionen av din insats i RNA.
i praktiken beskriver termen ”promotor” kombinationen av promotorn (RNA-polymerasbindningsstället) och operatörer (svarselement). Promotorer är cirka 100 till 1000 baspar långa och finns uppströms om deras målgener. Sekvensen för promotorregionen styr bindningen av RNA-polymeraset och transkriptionsfaktorerna, därför spelar promotorer en stor roll för att bestämma var och när din gen av intresse kommer att uttryckas.
RNA-polymeras(erna)
RNA transkriberas från DNA med hjälp av ett RNA-polymeras (RNAP). I bakterier görs detta av ett enda enzym; emellertid har eukaryoter muliplepolymeraser som var och en ansvarar för en specifik delmängd av RNA. För att få denna specificitet kan den eukaryota RNAP känna igen och binda till specifika promotorelement. Detta innebär att promotorn som finns i din plasmid-ryggrad måste vara kompatibel med den typ av RNA som måste göras: om du vill ha mRNA (för genuttryck) måste du använda en rnap II-promotor, medan små RNA (som shRNA) transkriberas från rnap III-promotorerna. Detta inlägg har promotorer för allmän rnap II och rnap III transkription; dock, med hjälp av virala ltr som RNAP II promotorer används vanligen i lentivirala och retrovirala konstruktioner och vi kommer att diskutera dessa i en framtida inlägg på viral vektor delar.
Promotorspecificitet
bortsett från att välja en promotor baserat på typ av RNA-transkript, måste du också se till att din plasmid har en promotor som passar för att arbeta i din värdorganisme. Eftersom transkriptionsmaskiner skiljer sig mellan celltyper eller organismer måste promotorer vara lika variabla. Bakteriella promotorer fungerar endast i prokaryota celler och vanligtvis endast i samma eller närbesläktade arter från vilka de härleddes. På samma sätt kräver de olika eukaryota celltyperna (däggdjur, jäst, växter, etc) unika promotorer och det finns väldigt lite crossover. Generellt sett är promotorer i bakterier mindre olika och komplexa och har färre delar än de i eukaryota celler. Vissa initiativtagare är konstitutivt aktiva och hela tiden medan andra kontrolleras mer noggrant. Reglerade promotorer kan agera endast i vissa vävnader eller vid vissa tider i utveckling eller det kan finnas sätt att slå på eller stänga av dem efter behag med en kemikalie, värme eller ljus. I cellen styrs promotorerna själva av ytterligare andra regleringsfaktorer: förstärkare, gränselement, isolatorer och ljuddämpare; emellertid kan viss ”läckage” av transkription förekomma. Detta är normalt inte en stor Fråga för celler, men det kan förvirra forskningsresultat eller till och med döda dina celler om din gen av intresse är giftig. För att bekämpa detta har forskare skapat syntetiska promotorer, som vanligtvis innehåller en kombination av andra promotorelement, och tenderar att vara tätare reglerade.
vanliga promotorer för eukaryoter och prokaryoter
vi har inkluderat två referenstabeller nedan som listar några av de vanligaste bakterie-och däggdjurspromotorerna. Dessa listor är ingalunda uttömmande, men bör vara ett bra ställe att börja när man försöker välja din perfekta promotor!
eukaryota promotorer
| promotor | används främst för | RNA-transkript | beskrivning | uttryck | ytterligare överväganden |
| CMV | allmänt uttryck | mRNA | stark mammalian expression promotor från humant cytomegalovirus | konstitutiv | kan innehålla en förstärkarregion. Kan tystas i vissa celltyper. |
| EF1a | allmänt uttryck | mRNA | starkt däggdjursuttryck från mänsklig förlängningsfaktor 1 alfa | konstitutiv | tenderar att ge konsekvent uttryck oavsett celltyp eller fysiologi. |
| SV40 | allmänt uttryck | mRNA | Mammalian expression promotor från simian vacuolating virus 40 | konstitutiv | kan inkludera en förstärkare. |
| PGK1 (människa eller mus) | allmänt uttryck | mRNA | Däggdjurspromotor från fosfoglyceratkinasgen. | konstitutiv | utbrett uttryck, men kan variera beroende på celltyp. Tenderar att motstå promotor nedreglering på grund av metylering eller deacetylering. |
| Ubc | allmänt uttryck | mRNA | Däggdjurspromotor från den mänskliga ubiquitin C-genen | konstitutiv | som namnet antyder är denna promotor allestädes närvarande. |
| humant betaaktin | allmänt uttryck | mRNA | Däggdjurspromotor från betaaktin gen | konstitutiv | allestädes närvarande. Kycklingversion används ofta i promotorhybrider. |
| CAG | allmänt uttryck | mRNA | Stark Hybrid däggdjur promotor | konstitutiv | innehåller CMV förstärkare, kyckling beta aktin promotor, och kanin beta-globin skarv acceptor. |
| TRE | allmänt uttryck | mRNA | Tetracyklinresponselementpromotor | inducerbar med Tetracylin eller dess derivat. | innehåller vanligtvis en minimal promotor med låg basal aktivitet och flera tetracyklinoperatörer. Transkription kan slås på eller av beroende på vilken tet-transaktivator som används. |
| UAS | allmänt uttryck | mRNA | Drosophila promotor conaining Gal4 bindningsställen | specifik | kräver närvaron av Gal4-genen för att aktivera promotorn. |
| Ac5 | allmänt uttryck | mRNA | stark insektspromotor från Drosophila Actin 5C-gen | konstitutiv | vanligen används i uttryckssystem för Drosophila. |
| Polyhedrin | allmänt uttryck | mRNA | stark insektspromotor från baculovirus | konstitutiv | vanligen används i expressionssystem för insektsceller. |
| CaMKIIa | genuttryck för optogenetik | mRNA | Ca2+/kalmodulin-beroende proteinkinas II promotor | specifikt | används för neuronal/CNS-uttryck. Modulerad av kalcium och kalmodulin. |
| GAL1, 10 | allmänt uttryck | mRNA | jäst intill, avvikande transkriberade promotorer | inducerbar med galaktos; repressibel med glukos | kan användas oberoende eller tillsammans. Reglerad av GAL4 och GAL 80. |
| TEF1 | allmänt uttryck | mRNA | jästtranskriptionsförlängningsfaktorpromotor | konstitutiv | analog med ef1a-promotor från däggdjur. |
| GDS | allmänt uttryck | mRNA | stark jästuttryckpromotor från glyceraldehyd 3-fosfagdehydrogenas | konstitutiv | mycket stark, även kallad TDH3 eller GAPDH. |
| ADH1 | allmänt uttryck | mRNA | Jästpromotor för alkoholdehydrogenas i | undertryckt av etanol | Full längd version är stark med högt uttryck. Stympade promotorer är konstitutiva med lägre uttryck. |
| CaMV35S | allmänt uttryck | mRNA | stark växtpromotor från Blomkålmosaikviruset | konstitutiv | aktiv i dikot, mindre aktiv i monokot, med viss aktivitet i djurceller. |
| Ubi | allmänt uttryck | mRNA | Växtpromotor från majs ubiquitin gen | konstitutiv | ger högt uttryck i växter. |
| H1 | litet RNA-uttryck | shRNA | från humant polymeras III RNA-promotor | konstitutiv | kan ha något lägre uttryck än U6. Kan ha bättre uttryck i neuronala celler. |
| U6 | litet RNA-uttryck | shRNA | från den mänskliga U6-lilla kärnpromotorn | konstitutiv | Murine U6 används också, men kan vara mindre effektiv. |
prokaryota promotorer
| promotor | används främst för | beskrivning | uttryck | ytterligare överväganden |
| T7 | in vitro transkription/ allmänt uttryck | promotor från T7 bakteriofag | konstitutiv, men kräver T7 RNA-polymeras. | när det används för in vitro-transkription, Driver promotorn antingen sense-eller antisense-transkriptet beroende på dess orientering mot din gen. |
| T7lac | höga nivåer av genuttryck | promotor från T7-bakteriofag plus lac-operatörer | försumbar basal uttryck när den inte induceras. Kräver T7 RNA-polymeras, som också styrs av lac-operatören. Kan induceras av IPTG. | som vanligtvis finns i pET-vektorer. Mycket tätt reglerad av lac-operatörerna. Bra för att modulera genuttryck genom olika inducerkoncentrationer. |
| Sp6 | in vitro transkription/ allmänt uttryck | promotor från SP6 bakteriofag | konstitutiv, men kräver SP6 RNA-polymeras. | SP6-polymeras har en hög processivitet. När den används för in vitro transkription, promotorn Driver antingen sense eller antisense transkript beroende på dess orientering till din gen. |
| araBAD | allmänt uttryck | promotor av arabinos metabolisk operon | inducerbar av arabinos och undertryckt katabolit förtryck i närvaro av glukos eller genom konkurrensbindning av anti-inducerare fukos | svagare. Vanligt förekommande i pBAD-vektorer. Bra för snabb reglering och lågt basalt uttryck; dock inte väl lämpad för modulering av genuttryck genom olika inducerkoncentrationer. |
| trp | höga nivåer av genuttryck | promotor från E. coli tryptofan operon | Repressible | blir avstängd med höga nivåer av cellulär tryptofan. |
| lac | allmänt uttryck | promotor från lac operon | konstitutiv i frånvaro av lac repressor (lacI eller lacIq). Kan induceras av IPTG eller laktos. | läckande promotor med något svagt uttryck. lacIq-mutation ökar uttrycket av repressorn 10x, vilket stramar reglering av lac-promotorn. Bra för att modulera genuttryck genom olika inducerkoncentrationer. |
| PTAC | allmänt uttryck | Hybridpromotor av lac och trp | reglerad som lac-promotorn | innehåller -35-region från trpB och -10-region från lac. Mycket snäv reglering. Bra för att modulera genuttryck genom olika inducerkoncentrationer. Generellt bättre uttryck än lac ensam. |
| PL | höga nivåer av genuttryck | promotor från bakteriofag lambda | kan vara temperaturreglerbar | ofta parat med den temperaturkänsliga cI857 repressorn. |
| T3 | in vitro transkription/allmänt uttryck | promotor från T3 bakteriofag | konstitutiv, men kräver T3 RNA-polymeras | när den används för in vitro transkription, promotorn Driver antingen sense eller antisense transkript beroende på dess orientering till din gen |
även om den här listan är ett bra ställe att börja, dyker inte tabellerna ovan in i de vävnads-eller utvecklingsspecifika promotorer som är tillgängliga för forskare. Plasmider används ofta för terapeutisk användning, och i dessa fall är det viktigt att identifiera rätt vävnadsspecifika promotorer som beskrivs av forskare vid NIH här.
Obs: A. Max Juchheim bidrog till skrivandet av denna artikel.