mekanismer för kromosomala omarrangemang i det mänskliga genomet

patologiska Dsb: er definieras godtyckligt som Dsb: er som inte tjänar något fysiologiskt syfte och kan leda till celldysfunktion.

slumpmässiga DNA-raster på grund av joniserande strålning eller oxidativa fria radikaler

i många kromosomala omarrangemang verkar Dsb: erna vid en eller båda generna lokaliseras slumpmässigt inom stora regioner med många kilobaser. Slumpmässig positionering och den uppenbara bristen på sekvensbenägenhet tyder på sekvensspecifika Dsb-mekanismer såsom oxidativa fria radikaler, joniserande strålning eller mindre vanligt spontan DNA-ryggradshydrolys.

ungefär hälften av den naturliga joniserande strålningen i miljön härstammar från naturliga tungmetaller i jorden, såsom uran, torium och till och med kalium. Den andra hälften av den joniserande strålningen härrör från kosmisk strålning som inte helt blockeras av atmosfären. Totalt passerar cirka 3 x 108 joniserande strålningspartiklar genom var och en av oss varje timme och producerar hydroxylfria radikaler från vatten i deras kölvatten. Detta område av hydroxylfria radikaler orsakar klusterskador på DNA och bryter därmed båda DNA-strängarna.

cirka 0,1% av syret som vi andas omvandlas till fria radikaler . Detta genererar 3 x1022 fria radikaler per timme inom var och en av oss, och dessa skadliga fria radikaler fördelas över 1014-cellerna i människokroppen. Fria radikaler orsakar övervägande enkelsträngad DNA-skada, men två närliggande sådana händelser kan resultera i en DSB.

RAG-åtgärd vid kryptiska RSS-platser utanför målplatser på ett sekvensspecifikt sätt: V (D) J-typ bryter

RSS heptamer/nonamer-konsensussekvensen är inte alls unik för Ig-och TCR-loci, och RAG-komplexet kan skära på platser som skiljer sig väsentligt från 16 bp-konsensus . Det minsta motivet för RAG nicking är bara CAC. Således kan RAG-komplexet verka på RSS-liknande icke-antigenreceptorlokusställen, benämnda kryptisk RSS (cRSS). Detta inträffar i många av de omarrangemang som observerats i humant T-cell akut lymfoblastiskt lymfom . I dessa fall, i stället för RAG komplexa para ihop en 12-RSS med en 23-RSS, en 12-RSS par med en 23-cRSS eller en 23-RSS par med en 12-cRSS. Vi kallar dessa raster v(D)j-typbrott eftersom de förekommer via samma mekanism som normal v (D)J-rekombination, oavsett det faktum att en av platserna ligger utanför de vanliga antigenreceptorlokalerna (det vill säga det är off-target).

RAG-verkan vid DNA-bubbelstrukturer och andra regioner av heteroologi på ett strukturspecifikt sätt

förutom dess sekvensspecifika skärningsläge kan RAG-komplexet också nicka på ett strukturspecifikt sätt vid övergångsställen från dsDNA till ssDNA, såsom förekommer vid kanterna av bubbla DNA-strukturer eller till och med enstaka missmatchningar . Sådan aktivitet av RAG-komplexet kan ha uppstått eftersom RAG-komplexet är vant vid att skapa hårnålstrukturer, vilket innebär väsentlig DNA-distorsion. Därför är varje region av missanpassning eller glidning ett potentiellt mål för nicking av RAG-komplexet i lymfoida celler.

RAG-medierad transposition som en mekanism för kromosomal omläggning

från 1998 till 2007 föreslog flera laboratorier att RAG-komplexet skulle kunna infoga de trubbiga RSS-innehållande ändarna från V(D)J-rekombination, benämnda signaländar, till nya platser i genomet. Detta kallas RAG transposition, och sker på en låg nivå med användning av en stympad form av RAG proteiner som kallas core RAGs (granskas i ). Försök att hitta RAG-transpositionshändelser in vivo visade emellertid att dessa var mycket mindre vanliga än slumpmässig integration av DNA . Slutligen finns det inga exempel på humana lymfoida maligniteter (eller någon annan typ av malignitet) där genomet förändrades genom en RAG-transpositionsinsättning av signaländar (eller någon annan uppenbar variant av ett sådant införlivande).

stödåtgärder på platser utanför målet

som nämnts i ovanstående diskussion om rekombination av klassomkopplare kan stöd konvertera C till U eller metyl C eller T i någon region av ssDNA. Detta verkar inträffa inte bara vid omkopplingssekvenser och variabla domäner i Ig loci, men också på vissa patologiska platser, såsom vissa onkogener som c-myc . När de riktas mot hjälp kan dessa regioner upprätthålla punktmutationer eller Dsb . Biståndsåtgärder vid IgH-omkopplingsregionen under CSR och oberoende biståndsåtgärder vid c-myc-genen för att skapa en DSB tros ligga till grund för de två initierande Dsb: erna i både mus-och humana c-myc-translokationer . Man kan betrakta raster av denna typ som CSR-typ raster (som nämnts ovan i diskussionen om klassomkopplare rekombination) eller SHM-typ raster, där SHM hänvisar till HJÄLPINITIERADE händelser av den typ som liknar vad som normalt inträffar vid somatisk hypermutation.

förmodad kombinerad verkan av stöd och trasor på CpG-platser: CPG-typbrott

Nyligen rapporterade vi att DSBs vid vissa loci i pro-B/pre – B-stegtranslokationer-bcl – 2 från t(14;18), bcl-1 från t(11;14) och E2A från t(1;19) – har en stark benägenhet att inträffa vid dinukleotidsekvensen CpG.

Bcl-2-translokationen är den vanligaste translokationen i cancer, som förekommer hos > 90% av follikulära lymfom och en tredjedel av diffusa storcellslymfom. Femtio procent av pauserna vid Bcl-2-genen förekommer inom major breakpoint region (MBR), vilket är en 175 bp hotspot i 3′ mest exon i regionen som kodar för 3 ’ UTR. Två mindre ofta använda hotspots är belägna 18 och 29 kb längre distalt till Bcl-2-genen, 105 bp Bcl-2 intermediate cluster region (icr) respektive 561 bp Bcl-2 minor cluster region (mcr). Vilken som helst av CpG-platserna inom någon av dessa tre Bcl-2-translokationszoner kan vara ett mål för en DSB . Tretton procent av BCL-2-translokationsbrott finns i icr och 5% i mcr.

användningen av CPG: er gäller också för BCL-1 major translokationskluster, vilket är den plats som är involverad i T(11;14) translokation. BCL-1-translokationen förekommer i nästan alla Mantelcellslymfom, med 30% av pauserna som inträffar vid 150 bp BCL-1 major translokation cluster (MTC).

CPG-typbrott förekommer också i en tredje lymfoid malignitet, t (1;19) i en liten andel av pre-B ALLs, en translokation som sker mellan Pbx1-genen och E2A-genen. Pauserna vid E2A-genen förekommer i en zon på endast 23 bp, och dessa Dsb: er är också signifikant grupperade runt CpG-platser . Alla tre translokationer som involverar bcl-2, bcl-1 och E2A förekommer vid pro-B/pre-B-stadiet av B-cellutveckling.

bcl – 2 MBR är reaktiv med en kemisk sond för enkelsträngning som kallas bisulfit . Liksom bcl-2 MBR är denna bcl-1 MTC relativt liten (150 bp) och har en liknande reaktivitet mot bisulfit . Dessa mycket bisulfit reaktiva zoner är rika på körningar av Cs. Baserat på cirkulär dikroism, röntgenkristallografi, NMR och kemisk sondering tenderar sådana körningar av Cs att anta en DNA-struktur som är mellanliggande mellan B-form DNA och A-form DNA, benämnd B/A-intermediär . B / A-mellanstrukturen har snabbare öppningskinetik, som kanske står för en del av den observerade ökningen av bisulfitreaktivitet. Sådana ovanliga DNA-regioner kan vara mer benägna att glida händelser, kanske induceras av DNA-replikation eller transkription. Detta kan då redogöra för deras sårbarhet i minikromosomala rekombinationsanalyser .

Cs för CPG: erna inom eller direkt intill dessa b/a-mellanliggande zoner har ökad risk att genomgå deaminering . Denna deaminering gäller inte alla Cs i regionen, utan endast Cs som finns inom CpG-webbplatser. Det enda utmärkande för sådana Cs inom CPG är att de kan metyleras av DNA-metyltransferas. När vanlig Cs deamineras blir de U, vilket resulterar i en U: G-matchning. Men när metyl Cs deamineras blir de T, vilket resulterar i en T: G-obalans. Reparationen av U: G-felmatchningar är mycket effektiv, men reparationen av T:G-felmatchningar är inte effektiv. Faktum är att t:G mismatch repair är så ineffektivt, det står för ungefär hälften av punktmutationerna vid p53-genen över ett brett spektrum av mänskliga cancerformer. Dessa T: G mismatch-webbplatser finns alltid på CpG-webbplatser.

Vad orsakar pausen vid dessa T: G-mismatch-webbplatser? Intressant nog verkar denna deaminering vid dessa lymfoida translokationshotspots inträffa vid differentieringsstadiet före B. Detta är stadiet av B-cellutveckling när D till J rekombination sker mest kraftigt. Eftersom Bcl-2 och bcl-1-translokationer inträffar i detta skede verkar detta sannolikt vara translokationsstadiet. Vi har visat att RAG-komplexet kan orsaka en DSB på platser med små bubbelstrukturer, och till och med enstaka basparmatchningar. (Som nämnts ovan återspeglar denna åtgärd av RAG-komplexet dess strukturspecifika nukleasaktivitet, kanske en egenskap som återspeglar de strukturspecifika åtgärderna av RAG-komplexet under hårnålbildningssteget för v(D)J rekombination.) Därför har vi föreslagit att RAG-komplexet gör Dsb:erna på platserna för T: G-felmatchning .

om RAG-komplexet orsakar Dsb: erna vid CpG-platser, varför uppstår inte sådana CPG-typbrott i pre-T-celler, vilket också uttrycker RAG-enzymkomplexet? B-celllinjen uttrycker ett cytidindeaminas för klassomkopplare rekombination och somatisk hypermutation. Som nämnts ovan kallas detta enzym aktiveringsinducerat deaminas (AID). Stöd uttrycks i B-celler men inte andra somatiska celler. Stöd uttrycks mest i B-celler när de befinner sig i groddcentren. En låg nivå av HJÄLPUTTRYCK har emellertid beskrivits i pre-B-celler . Dessutom tros B-celler som bara lämnar benmärgen, kallade övergångsb-celler, också uttrycka hjälp . Därför finns det en tidsperiod när B-celler fullbordar V(D)J-rekombination och börjar uttrycka hjälp när både AID och RAG-komplexet är närvarande i B-cellerna. Stöd har visat sig kunna deaminera metyl C till T. därför föreslår vi att stödet sannolikt är ansvarigt för mutationen av meC till T vid CpG-platser i tidiga B-celler. Den resulterande t: G-missmatchningen skärs sedan av RAG-komplexet, vilket resulterar i en DSB. Denna modell förklarar tre toppar av translokation som ligger inom bcl-2 MBR, som alla är centrerade på CpG-platser .

andra orsaker till patologiska Dsb: er med okänd mekanism

vissa translokationer är starkt associerade med typ II topoisiomerasinhibitorbehandling . Efter sådan behandling utvecklar vissa patienter sekundära maligniteter med dessa karakteristiska translokationer. Topoisomeraser i allmänhet gör enkel-eller dubbelsträngsbrott för att vinda eller varva ner DNA, så de har en nukleasaktivitet som en del av deras funktion. Efter lindning eller avveckling av DNA, förseglar de normalt pausen(erna). Det har föreslagits att avbrott eller förebyggande av återförslutning kan leda till stabila raster som ses i kromosomala omarrangemang .

vissa Dsb uppstår på platser i närheten av direkta eller inverterade DNA-upprepningar. Sådana upprepningar kan ge upphov till halkade DNA-strukturer som innehåller regioner av enkelsträngat DNA, som kan vara mål för klyvning. Det bästa exemplet på detta är den konstitutionella translokationen t (11;22) (q23; q11), som innehåller en AT-rik palindrom av flera hundra baser, med potential för korsformad bildning.

kombination av flera Dsb-mekanismer inom en omläggning

med tanke på att två Dsb: er krävs för att generera en translokation är de två pauserna ofta inte relaterade till varandra. I Bcl-2-och bcl-1-translokationerna är till exempel pausen vid IgH-locus en v(D)j-typbrytning genererad av den sekvensspecifika verkan av RAG-komplexet under V(D)J-rekombination. (Man kan betrakta detta som ett misslyckande vid slutförandet av den normala V(D)J rekombinationsprocessen .) DSB vid Bcl-2-eller bcl-1-lokuset är en CPG-typbrytning som har föreslagits bero på den sekventiella åtgärden av stöd och den STRUKTURSPECIFIKA nicking-aktiviteten hos RAG-komplexet .

även inom ett givet locus kan det finnas ett brett spektrum av DSB-mekanismer. SCL-och LMO2-loci upprätthåller huvudsakligen V(D)J-typ Dsb, men en tredjedel eller flera av DSB: erna är oförenliga med sekvenskraven för V (D)J-typ Dsb, och dessa kan bero på skador på fria radikaler, joniserande strålning eller topoisomeras fel. Olika loci inom en enda cell är därför benägna att olika typer av DSB-mekanismer.

Replikationsinducerad Dsbs

under DNA-replikation kan deletioner uppstå på grund av glidning av syntetiseringssträngen på mallsträngen. Kromosomala omarrangemang som förekommer vid specifika hotspots, oavsett om det är cancer i somatiska celler eller under gametogenes/initiala utvecklingsavdelningar som konstitutionella translokationer, kallas återkommande translokationer som kan ses hos många patienter. Icke-återkommande translokationer är de som förekommer på olika platser från en patient till en annan men förändrar eller inaktiverar en gen som orsakar en sjukdom. Till skillnad från de återkommande translokationer som vi har diskuterat i cancer ovan verkar mekanismerna som orsakar strängutbytet i icke-återkommande translokationer involvera mallbyte under replikativ DNA-syntes. Dessa mallomkopplare kan förekomma vid små regioner av DNA-sekvenshomologi, såsom 5 bp. Denna mallväxling har kallats mikrohomologi-medierad brottinducerad replikering (MMBIR) eller Gaffelstopp och Mallväxling (FoSTeS). För nonrecurrent translokationskorsningar som involverar flera långa sekvenssträckor från regioner i genomet som normalt är separerade från varandra, flera mallväxlingshändelser har föreslagits som en mekanism .