kromosom 20-deletioner i myeloida maligniteter: reduktion av den vanliga raderade regionen, generering av en PAC/BAC contig och identifiering av kandidatgener

Kromosombandning och målning

Benmärgskromosompreparat av 107 fall med myeloida störningar analyserades genom G-banding för att bedöma storleken på borttagningen av den långa armen av kromosom 20. Som tidigare beskrivits (Nacheva et al., 1995b) identifierades två kategorier av 20Q-radering-stora raderingar (59 fall), vilket resulterade i förlust av båda Giemsa mörka band från 20q (Figur 1a, topp) och små raderingar (48 fall) där ett Giemsa mörka band kvarstår (Figur 1a, botten). Vi fokuserade därefter på den senare patientgruppen (sammanfattad i Tabell 1).

FISKANALYS med användning av en kromosom 20-färg utfördes på 48-proverna med en liten 20Q-radering. I sex fall avslöjades att’ 20Q-raderingen ’ berodde på kryptiska omarrangemang. I ett fall identifierade samtidig applicering av färger för kromosomer 15 och 20 en markör härledd från kromosom 15 men två normala kromosom 20-homologer (Figur 1b). I de återstående fem fallen visade kromosommålning närvaron av en obalanserad translokation med en återkommande Brytpunkt vid 20q11.2 och variabla kromosompartners (figur 1C). I alla fem fallen var der (20) – markören den enda translokationsprodukten som behölls i genomet. Vidare visade Fish-kartläggning att brytpunkten på kromosom 20 hade inträffat i en region proximal till D20S107 och bekräftad förlust av resten av den långa armen av kromosom 20 (data visas inte). Dessa resultat kommer att rapporteras i detalj någon annanstans.

i de återstående 42 Fallen överensstämde kromosommålning med en liten interstitiell deletion av 20q (figur 1D). Majoriteten (33 fall) bar en 20Q-radering som den enda karyotypiska abnormiteten. I de återstående nio Fallen åtföljdes 20Q-raderingen av olika ytterligare kromosomavvikelser (Tabell 1). Alla 42 fall med en liten 20Q-radering utsattes för ytterligare fiskkartläggning med locus-specifika sonder.

Deletion mapping analysis

de 42 patienterna med små 20Q deletioner analyserades med FISH med användning av en centromerisk PAC (CEP20), en PAC-hybridisering till en distal region av 20q (LSI 20q13) och en PAC-hybridisering inom CDR (LSI D20S108). I varje patient observerades signaler från både LSI 20q13 och CEP20 men inte LSI D20S108 på den raderade kromosomen 20 som bekräftade närvaron av en interstitiell deletion (sammanfattad i Figur 3). Metafaser från varje patient hybridiserades sedan med PACs-kartläggning vid gränserna för den kända MPD och MDS/AML CDRs–D20S107 som ligger vid den proximala gränsen för CDRs och D20S176 som ligger telomer av den distala gränsen för CDRs (Bench et al., 1998A; Wang et al., 1998).

hos 37 patienter (25 med MDS eller AML, 12 med MPD) misslyckades båda sonderna med att producera en signal på den raderade kromosomen 20 som visar närvaron av omfattande borttagningar som inte skulle hjälpa till att förfina cdr: erna. Sådana prover undersöktes inte ytterligare. Men hos fyra patienter med MDS (DB53, MH40, DB122 och DB214) och en med MPD (JH41) gav en av de två sonderna en signal på den borttagna kromosomen 20 och dessa prover analyserades mer detaljerat.

förutom de 42 patienterna med små 20Q-deletioner som analyserades med FISH med hjälp av locus-specifika sonder, analyserades ytterligare sex patienter med en 20Q-deletion (fyra med MDS, två med MPD), från vilka benmärgsmetafaser inte var tillgängliga, med användning av mikrosatellit-PCR. DNA från renade granulocyter och T-celler analyserades med användning av en stor panel av polymorfa markörer som sträckte sig över MPD och MDS/AML cdr (Tabell 2). Alla fyra MDS-patienter hade raderingar som sträckte sig utöver gränserna för den publicerade CDR. I en av de två MPD-patienterna (RB42) minskade emellertid den centromera gränsen för deletionen avsevärt MPD CDR (Figur 2, Tabell 2).

reduktion av den vanliga borttagna regionen hos MDS / AML-patienter

preliminär FISH-analys identifierade fyra MDS-patienter med deletioner som inkräktade på MDS/AML CDR. I varje fall var 20Q-raderingen närvarande i alla undersökta metafaser. I tre fall (DB53, DB214 och MH40) var 20Q-raderingen närvarande som en enda abnormitet. I patient DB122 var 20Q-deletionen den ursprungliga enda avvikelsen med två subkloner innehållande trisomi 21 eller trisomi 8 och trisomi 21 utöver 20Q-deletionen också närvarande. Dessa fyra fall studerades med hjälp av ytterligare locus – specifika sonder för att fastställa raderingsgränserna.

den proximala gränsen för MDS / AML CDR förfinades av patienter DB53, MH40 och DB122. Den proximala gränsen för raderingen i DB53 låg mellan D20S107 och WI-11538 (Figur 3), ett avstånd på cirka 400 kb. För patient MH40 gav en PAC innehållande WI-11538 (dJ357E14) konsekvent upphov till en reducerad signal som överensstämde med närvaron av den proximala raderingsbrytpunkten inom denna PAC (Figur 3). Vidare låg den proximala gränsen för raderingen i patient DB122 mellan sts-R52161 och stSG25449 (figur 1e,f), ett avstånd på mindre än 200 kb (Figur 3 och 4). Detta representerar en stor förfining av den proximala gränsen för MDS/AML CDR.

Patient DB214 tillät avsevärd förfining av den distala gränsen för MDS/AML CDR. Den distala gränsen för denna radering låg mellan WI-12515 och stSG40369 (figur 1g,h), ett avstånd på mindre än 100 kb (Figur 3 och 4).

dessa data minskar därför MDS/AML CDR avsevärt till en region som ligger mellan PAC dJ620E11, som innehåller sts-R52161, och PAC dJ196H17 som innehåller WI-12515 (figurerna 3 och 4). Bakterieklonen contig som presenteras nedan visar att den fysiska storleken på denna region är ungefär 2,6 Mb.

reduktion av den vanliga borttagna regionen hos MPD-patienter

hos patient JH41 (diagnos PV) hade den proximala gränsen för raderingen tidigare bestämts av mikrosatellit PCR att ligga mellan d20s438 och D20S107 (Bench et al., 1998a). PAC dJ155H19, som innehåller D20S107 (Figur 4), gav konsekvent upphov till en reducerad signal som överensstämmer med närvaron av den proximala raderingsbrytpunkten inom denna PAC (Figur 3).

granulocyter och T-celler från ytterligare två patienter undersöktes med användning av mikrosatellit-PCR (Tabell 2). En patient med PV (RB42) visade retention av heterozygositet vid D20S108 men förlust vid D20S858 (Figur 2, Tabell 2). Den proximala brytpunkten för borttagningen i denna patient låg mellan D20S108 och D20S858, ett avstånd på mindre än 200 kb (figurerna 3 och 4).

dessa data minskar kraftigt MPD CDR whicih flankeras nu av D20S108 (denna studie) och D20S481 (Wang et al., 1998). Den beräknade fysiska storleken på denna region är 2.7 Mb, med hjälp av data från bakterieklonen contig presenteras nedan. Området för överlappning mellan den nya MDS / AML och MPD cdr definierade en kombinerad ’myeloid’ CDR på 1,7 Mb (Figur 3).

en bakteriell klon contig som spänner över MPD och MDS / AML vanliga borttagna regioner

vi hade tidigare konstruerat en 11 Mb YAC contig av denna region av kromosom 20 (Bench et al., 1998a). För att producera en mer detaljerad fysisk karta har vi nu konstruerat en sammanhängande PAC-och BAC-baserad karta. PAC-och BAC-kloner identifierades genom hybridisering av STSs till genomiska bibliotek (Ioannou et al., 1994; Osoegawa et al., 1998). Kloner överlappades med begränsningsfingeravtryck (Gregory et al., 1997) och STS-innehållskartläggning som gör att kloner kan grupperas i contigs. För att överbrygga contigs användes nya STSs-och DNA-sonder, utvecklade från ändarna av contigs, för ytterligare biblioteksscreening. Nya PACs och BACs slogs sedan samman till contigs på samma sätt tills en sammanhängande karta producerades.

bakterieklonen contig innehåller totalt 456 bakteriekloner varav 376 är PACs och 80 är BACs. Den sträcker sig från D20S607 till SEMG1 och innehåller 202 DNA-markörer varav 185 är STSs och 17 är DNA-prober. Storleken på contig baserades på i genomsnitt 3, 5 kb per HindIII-fingeravtrycksband (P Deloukas (2000), opublicerade resultat). Den uppskattade storleken på contig beräknades som 5 Mb genom att multiplicera det totala antalet olika fingeravtrycksband inom contig med 3,5. En representation av kartan som illustrerar den minimala kakelvägen och PACs som användes för FISKEXPERIMENT visas i Figur 4. En fullständig version av kartan finns på http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/ace/pic/20ace?name = Chr_-20ctg125&class=Map.

identifiering av uttryckta sekvenser

fyrtiotre unika Ester lokaliserades mellan d20s607 och stSG34035 inklusive. Av dessa kartlades 34 est genom hybridisering till en ’polygrid’ av PACs och BACs eller genom koloni PCR av bakteriekolonier innehållande PACs eller BACs (Figur 4). Ytterligare nio ester, som tidigare kartlagts i denna region av kromosom 20 (Bench et al., 1998A; Deloukas et al., 1998) placerades på contig genom BLASTINRIKTNING av EST-sekvensen med den tillgängliga PAC-eller BAC-genomiska sekvensen.

för att identifiera förmodade nya uttryckta sekvenser sekvenserades 23 PAC-kloner från den minimala kakelvägen delvis eller fullständigt. Den genomiska sekvensen av dessa kloner analyserades med hjälp av NIX-programmet (Williams et al., 1998) som möjliggör samtidig observation av ett antal genidentifieringsverktyg inklusive GRAIL, GENSCAN och BLAST. Åtta tidigare omappade Ester och gener identifierades (tabell 3). Sex av dessa låg inom MPD CDR och sju låg inom MDS CDR. Bevis erhölls att sex av dessa åtta förmodade uttryckta sekvenser representerade bona fide transkriberade gener, snarare än bearbetade pseudogener eller genomiska DNA-föroreningar i Est-databasen. KCNS1 är en gen som kodar för en kaliumspänningsgrindad kanalsubenhet. ESTs AA053206 / AA053121 befanns därefter härledas från sgk2-genen (Kobayashi et al., 1999). Anpassning av cDNA-sekvens till genomisk sekvens demonstrerade en exon/intron-struktur för tre av de återstående sex esterna (AI312497, AA568401 och aa910031) med skarvplatsen konsensussekvens närvarande vid alla exon / intron gränser. I alla tre av dessa fall bekräftades närvaron av varje exon av exon-förutsägelsesprogram som GRAIL. Förekomsten av en exon förutspåddes också av GRAIL, GENSCAN och Genefinder inom regionen PAC dJ1108D11 som anpassade sig till EST AA993161 vilket antyder att denna EST också representerade en transkriberad gen.

sekvensanalys av PACs från den minimala kakelvägen gjorde det också möjligt för oss att fastställa den genomiska strukturen hos kända och nya gener i denna region. Anpassning av RPTPrho cDNA till PACs dJ1121H13, dJ707K17, dJ81G23, dJ230I19, dJ3E5, dJ232N11 och dJ269M15 visade att denna gen spänner över minst 1,2 Mb. PAC dJ138B7 innehöll två gener(h-L (3)mbt och SGK2) såväl som 5′-delen av genen motsvarande SHGC-36858. I synnerhet innehåller H-L (3) mbt-genen 20 exoner med två förmodade alternativa slutliga exoner. Analys av dJ644L1 visade att den mänskliga MafB-genen består av en enda exon. Analys av färdig sekvens utfördes också av Sanger Center (http://www.sanger.ac.uk/HGP/Humana) och detta kan ses vid http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/webace?db=acedb20&class=GenomeSequence.

dessa data fastställer närvaron av sex gener och ytterligare 14 unqiue ESTs inom den nya MDS/AML CDR och totalt 14 gener med 23 unika ESTs inom den nya MPD CDR (tabell 3). Sex gener och 10 unika Ester finns i området för överlappning mellan de två cdr: erna.

Uttrycksprofilering

myeloproliferativa störningar, myelodysplastiska syndrom och akut myeloisk leukemi tros bero på transformation av en multipotent cell i det hematopoetiska stamcellsfacket (Bonnet and Dick, 1997; Kralovics and Prchal, 1998). Dessutom har det tidigare visats att 20Q-raderingen kan uppstå i en stamcell som kan ge upphov till både myeloida celler och B-celler (White et al., 1994). Dessa överväganden tyder på att genen eller generna på kromosom 20q som är inaktiverade vid dessa sjukdomar sannolikt kommer att uttryckas i normala hematopoetiska stamceller. Vi bestämde därför vilka av de transkriberade sekvenserna som uttrycktes i benmärg och renade CD34-positiva celler.

omvänd transkription PCR (RT–PCR) amplifiering utfördes med primers som representerar var och en av den 51 transkriberade sekvensen (Figur 5). Minst två oberoende RT–PCR-förstärkningar utfördes för varje transkriberad sekvens. Primers motsvarande en EST (WI-7685) härledd från 3′ UTR av CD34-genen användes som en positiv kontroll (Figur 5). Där två eller flera est motsvarade samma transkriberade sekvens erhölls samma resultat för varje EST.

uppgifterna presenteras i Figur 5, tabellerna 3 och 4. Av de 37 uttryckta sekvenserna i MPD CDR uttrycktes 20 i benmärgsmononukleära celler. Av dessa uttrycktes 16 också i CD34-positiva celler. Inom MDS / AML CDR uttrycktes 11 av 20 transkriberade sekvenser i benmärgsmononukleära celler. Av dessa uttrycktes åtta också i CD34-positiva celler. Av de 16 transkriberade sekvenserna som ligger inom överlappningsområdet mellan MPD och MDS/AML cdr, uttrycktes åtta i benmärgsceller, varav fem också uttrycktes i CD34-positiva celler. Dessa fem transkriberade sekvenser representerar därför primära kandidatgener eftersom de ligger inom både MPD och MDS/AML CDR och uttrycks i det hematopoietiska stamcellsfacket. De inkluderar två okända gener som motsvarar ESTs SHGC-36858 och WI-12515 samt tre gener, SFRS6, h-L(3)mbt och MYBL2.