när du tänker på att separera proteiner, tänker du på att separera dem med en gel? Specifikt använder SDS-PAGE? Om du svarade ” ja ” är det med god anledning. SDS-PAGE är allestädes närvarande i molekylärbiologiska laboratorier eftersom det är bra på att separera proteiner. SDS-PAGE tar dock mycket tid och är arbetsintensiv. Så låt oss utöka din verktygslåda och titta på ett annat sätt att separera proteiner: Kapillärgelelektrofores.
Kapillärgelelektrofores (CGE) Alias kapillär siktningselektrofores Alias.a. SDS-kapillärgelelektrofores separerar proteiner i en gel via kolumner fyllda med ett separeringsmedium.
utrustningskrav
i kapillärgelelektrofores migrerar dina analyter (proteinerna du vill studera) genom en elektrolytisk lösning genom kapillärer genom dragkraften hos ett elektriskt fält – inte till skillnad från den mer bekanta SDS-sidan. För att utföra CGE behöver du: en provflaska, käll-och destinationsflaskor, siktmatris, kapillärkolonn, en kolonndetektor, en datautgång och hanteringsanordning och en högspänningsströmförsörjning.
protokoll i korthet
i ett CGE-experiment börjar ditt prov vid källflaskan och går mot destinationsflaskan. Här är protokollet i korthet:
Steg 1: källan och destinationsflaskorna samt kapillären som förbinder dem fylls med en elektrolytisk lösning och provet införs i kapillären.
steg 2: när det elektriska fältet har applicerats migrerar analyterna från källflaskans sida till destinationsflaskans sida.
steg 3: on-kolonn detektor (inte överraskande) möjliggör on-kolonn upptäckt. Detektorn skickar data till en datautgång och hanteringsenhet, till exempel en dator.
steg 4: dessa data visas sedan som ett elektroferogram. Dina analyter läses som toppar av olika retentionstider.
för att hitta mer information om hur detta fungerar, besök UC Davis hjälpsamma material.
mer om matrisen
din siktmatris kan bestå av ett antal polymeriserade material, inklusive tvärbunden polyakrylamid, dextran och poly(etylenglykol eller etylenoxid). Dina kolumner är vanligtvis gjorda av utbytbara siktpolymerer. Det är då upp till dig om du gör dina egna kolumner eller köper dem. Beckman Coulter, Agilent Tech och Bio-Rad Laboratories säljer siktningssatser men vet att dessa kräver att du använder deras CGE-instrument också.
varför ska du använda CGE
nu har du hört talas om vad CGE är, varför ska du använda det?
- den har kortare driftstider. Att köra en CGE tar 10-100 gånger mindre tid att slutföra än plattgelelektrofores.
- det finns färre steg i ett CGE-experiment än i ett SDS-PAGE-experiment. Detta beror på att slutresultatet av CGE-experimentet ges av en dator ansluten till apparaten.
- CGE är också bättre lämpad för små proteiner än traditionell SDS-sida.
- du kan analysera dina proteiner i realtid med CGE.
- CGE-utrustning kan användas upprepade gånger, utan att behöva göra oändliga geler.
- slutligen är mycket av processen automatisk. När du har lagt till ditt prov är du klar! Det betyder att du inte behöver övervaka processen som om du gör en gel eller ta den till speciell detekteringsutrustning så snart gelen har gått.
varför ska du inte använda CGE
Tja, sanningen berättas även om CGE har funnits i sin nuvarande form i över ett decennium och många tekniska framsteg har gjorts, lider CGE fortfarande av reproducerbarhetsproblem. Ett annat problem är att CGE-separationer utförs i serie. Det betyder att med CGE kan du inte enkelt jämföra banor. Slutligen, när det gäller 2D-geler, kan CGE bara inte konkurrera med traditionell 2D-separation.
Sammanfattningsvis, medan vissa forskare stolt utropar användningen av CGE-teknik, finns det fortfarande ett antal problem med det. Men avvisa inte CGE ännu! Det senaste trycket på detta område är microchip CGE, vilket visar mycket löfte för höghastighetsproteinanalys. Så nästa gång du tänker på proteinseparation glöm inte CGE.
har du provat CGE? Hur tycker du om det jämfört med SDS-PAGE?