jämförande mätning av CNP och NT-proCNP i humana blodprover: en metodologisk utvärdering

introduktion

C-typ natriuretisk peptid (CNP), identifierad 1990 av Sudoh et al., är den äldsta medlemmen av den natriuretiska peptidfamiljen . CNP stimulerar selektivt den humana natriuretiska peptidreceptorn 2 (NPR2), som aktiverar cGMP-beroende Kinas (cGK) genom att höja intracellulär koncentration av cGMP . Dessutom binder CNP npr3 och inaktiverar i sin tur proteinkinas A genom Gi-proteinberoende hämning av adenylatcyklas . CNP har anti-proliferativa och anti-migrerande egenskaper och identifierades också som en endotel härledd avslappnande faktor . Vidare hämmar CNP neointimal restenos, minskar vaskulär konstriktiv ombyggnad och hjärtischemi-reperfusionsskada . CNP spelar en viktig roll i bentillväxt, reproduktion, nervtillväxt, reendotelisering, såväl som njur -, bukspottkörtel-och hjärtfunktion . Dessutom har CNP nyligen erkänts vara involverad i utvecklingen av aterosklerotisk plackbildning .

på grund av överflödet av CNP-funktioner har denna peptid uppnått ökat intresse för Kardiovaskulär forskning under de senaste åren. Studier avseende CNP-koncentrationer i blodprover är emellertid inkonsekventa. Några av dessa studier mätte koncentrationer av CNP eller dess amino-terminal pro-peptid (NT-proCNP) i serumprover och andra använde plasmaprover . Tyvärr har detaljer om potentiella förseningar under blodprovtagning och efterföljande provbehandling ännu inte rapporterats. I den tillgängliga litteraturen hittills finns inga data om skillnaden mellan CNP / nt-proCNP-koncentrationer mellan serum-och plasmaprover. Påverkan av fördröjningen av blodprovbehandling förblir också oklart. Dessutom varierade CNP-koncentrationen i serum-och plasmaprover markant (Tabell 1). Därför var syftet med denna studie att svara på följande metodologiska frågor: (1) orsakar försenad behandling av blodproverna lagrade vid rumstemperatur förspänning? (2) finns det någon skillnad mellan serum-och plasmakoncentrationer av CNP eller NT-proCNP? (3) är dessa skillnader tidsberoende?

metoder

vi studerade 12 manliga volontärer (medelålder 29 kg 2 år, normal vikt, ingen läkemedelsbehandling, ingen historia av hjärt-kärlsjukdomar eller andra sjukdomar, 3 rökare). Från alla undersökta ämnen erhölls informerat samtycke. Tripletter av fastande blodprover togs från alla volontärer klockan 8 på morgonen. Blodprover samlades in med hjälp av en 7,5 ml S-Monovette® collection system (Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland) innehåller antingen koagulering aktivator (Kaolin) för serumprover, natrium-citrat för plasma prover eller Kalium–EDTA för full blodprov. Alla prover för baslinjeanalyser centrifugerades omedelbart vid 2,000 xnumx xnumx g för 10 min vid 4 xnumx xnumx C och supernatant lagrades vid -70 xnumx xnumx C tills analys. För halvtidsanalyser (30 minuter eller 2 timmar) centrifugerades plasmaprover vid 2 000 kg i 10 minuter vid rumstemperatur. Supernatanten avlägsnades och lagrades vid rumstemperatur i 30 minuter eller 2 timmar. Efter blodkoagulering behandlades serumprover identiskt med plasmaprover. Supernatant sparades och lagrades också vid rumstemperatur i 30 minuter eller 2 timmar. Fullständiga blodprover lagrades vid rumstemperatur utan centrifugering. Efter 30 minuter eller 2 timmar centrifugerades fullständiga blodprover vid 2000 kg i 10 minuter vid 4 kg C. Supernatant avlägsnades och lagrades vid -70 kg C tills analys. Koncentrationen av CNP mättes med användning av CNP-22 EIA Kit (#EK-012-03, Phoenix Pharmaceuticals, Karlsruhe, Tyskland) enligt tillverkarens protokoll. Nt-proCNP-koncentrationen mättes med hjälp av NT-proCNP EIA Kit (Biomedica, Wien, Österrike) enligt tillverkarens protokoll. Envägs ANOVA användes för jämförelse mellan grupper. För parvisa jämförelser tillämpades t-testet. Data visas som medel för standardavvikelse (SD) eller 95% konfidensintervall (95%-CI). Statistisk signifikans antogs vid p < 0,05. Data analyserades med hjälp av MedCalc Macau för Windows, Version 10.0.1.0 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgien).

resultat

som visas i Figur 1a var baslinjekoncentrationerna av CNP i serum, plasma och fullständiga blodprover 0,997 0,379 ng/ml, 1,933 0,699 ng/ml respektive 0,991 0,489 ng/ml. Plasmakoncentrationerna av CNP var signifikant högre jämfört med serum-och fullständiga blodprover vid alla tidpunkter (ANOVA, p = 0, 001 vid baslinjen, p < 0, 001 vid 30′ min. och p = 0,003 vid 120 ’ min.). Ingen signifikant skillnad observerades mellan serum och fullständiga blodprover vid någon tidpunkt (ANOVA, p > 0, 05). Baslinjekoncentrationer av NT-proCNP i serum, plasma och fullständiga blodprover var 58,5 28,3 pg/ml, 60,3 23,9 pg/ml och 50,7 21,4 pg/ml (Figur 1b). Ingen signifikant skillnad hittades mellan grupperna vid någon tidpunkt (ANOVA, p > 0,05). I fullständiga blodprover ökade koncentrationen av laktat signifikant efter 2 timmar jämfört med baslinjevärdet (3,2 0,8 mm till 2,0 0,6 mm, p < 0,001). Dessutom minskade pH-värdet från 7,34 0.03 vid baslinjen till 7,29 0,03 0,03 efter 2 timmar (p < 0,001).

diskussion

vår studie visade att CNP och NT-proCNP är stabila i serum och i fullständiga blodprover i minst två timmar vid rumstemperatur. Följaktligen påverkas stabiliteten hos CNP-peptiden sannolikt inte av någon fördröjning i provbehandling under minst två timmar. ProCNP har redan rapporterats (tillverkarens protokoll, okända lagringsförhållanden för blodprover) för att vara stabila i minst 2, 5 timmar. Följaktligen bekräftade våra experiment stabiliteten hos NT-proCNP även vid rumstemperatur. Koncentrationen av NT-proCNP i alla Provtyper förblev konstant under tidskursen i upp till 2 timmar, vilket indikerar långvarig stabilitet hos detta protein. Som förtecknas i Tabell 1, Den genomsnittliga koncentrationen av NT-proCNP (56,5 24 kcal.3 pg/ml) uppmätt i denna studie låg inom det rapporterade intervallet (se Tabell 1) för friska individer (3,7-432 pg/ml).

till skillnad från NT-proCNP var koncentrationen av CNP signifikant högre i plasmaprover jämfört med serum-och fullblodsprover (Figur 1). Hittills har varken vår grupp eller tillverkarens tekniska tjänst hittat några bevis för påverkan av provtyp på ELISA-analysen som användes i denna studie. Vid baslinjen var emellertid supernatant av plasma och fullständiga blodprover identiska med undantag för vilken typ av blodkoagulationshämmare som användes. Denna hämmare var natriumcitrat i plasmagruppen och EDTA i hela blodprovgruppen. Fullständiga blodprover visade jämförbara resultat med serumprover (p = 0,98). Därför är det troligt att natriumcitrat signifikant kan påverka den uppmätta koncentrationen av CNP i plasma och följaktligen förfalska de resultat som uppnåtts med denna teknik.

oväntat var baslinjekoncentrationerna av CNP i både plasma-och serumprover ungefär tusen gånger högre än i andra rapporter (Tabell 1) . I alla dessa studier användes Radioimmunoassay (RIA-Kit) för bestämning av CNP-koncentrationer. Däremot var de uppmätta CNP-koncentrationerna i serum-och plasmaprover i två andra studier jämförbara med våra resultat med avseende på dimensionens storlek . Intressant, i de senare studierna användes samma ELISA-Kit som i vår undersökning. Även efter omfattande utvärdering av olika interna och externa faktorer kunde ingen nöjd förklaring av denna skillnad hittas. Kontrollmätningar med exogen CNP i humant serum avslöjade ett icke-signifikant mätfel på +7,8% (95%-KI: –). CNP-peptiden som användes för referenskurvan syntetiserades av tillverkaren själv (Phoenix). Däremot tillhandahölls CNP-peptiden som användes som den ”exogena” kontrollen av Bachem. Som försäkrade av båda tillverkarna var sekvenser av aminosyror identiska och disulfidbindningar bildades i båda peptiderna.

resultaten av interna kontrollmätningar kan dock sammanfattas enligt följande: Först visade kontrollmätningarna som utfördes i vår studie att ELISA-satserna användes korrekt, i enlighet med tillverkarens instruktioner. För det andra bekräftade mätningar med kontrollprover lämpligheten för standardkurva applicerad. För det tredje visade kontrollserumprover innehållande exogen CNP acceptabel noggrannhet och resultaten var inom den förväntade storleksordningen. För det fjärde är en högre koncentration av CNP i plasmaprover sannolikt en artefakt orsakad av natriumcitrat.

som rapporterats av Clerico och medarbetare är jämförelsevis stora skillnader i resultat mellan olika RIA-och MKB-metoder också kända för, t .ex. ANP och BNP. Clerico och medarbetare drog slutsatsen att de stora skillnaderna i dessa resultat troligen beror på specificiteten hos monoklonala eller polyklonala antikroppar som används, utformningen av immunanalyssystem (konkurrenskraftig vs icke-konkurrenskraftig analys), den analytiska matrisen (serum vs EDTA vs hepariniserad plasma) som används och överflödet av cirkulerande former av natriuretiska peptider, som tidigare rapporterats för ANP-och BNP-immunanalyser . Dessa metodologiska källor för bias kan också vara tänkbara för CNP-och nt-proCNP-analyser och förklarar därmed den stora skillnaden i resultat i de citerade studierna (Tabell 1).

begränsningar av studien

vi erkänner att en provstorlek på 12 är för liten för att dra slutsatsen att det inte finns någon skillnad alls. Ur statistisk synvinkel skulle det dock vara viktigt att ange hur stor skillnaden måste vara för att vara av medicinsk relevans. Så vitt vi vet är det senare ännu inte klart definierat. Därför gavs medel och 95% konfidensintervall för alla åtgärder i figuren för att göra det möjligt för varje läsare att också dra sin egen tolkning från data.

med hänvisning till serum-och plasmakoncentrationer måste det nämnas att värdena som rapporteras i Tabell 1 mättes med olika metoder (RIA, ELISA) hos patienter som lider av olika sjukdomar. Det skulle ha varit till stor hjälp att jämföra CNP-RIA med CNP-ELISA-analyser direkt med samma exemplar, eftersom en tusenfaldig skillnad i storleksordningen förblir märkbar. Tyvärr var Ria-analysmätningar inte tillgängliga i vårt laboratorium. För nt-proCNP-koncentrationen undersöktes den senare jämförelsen av Olney och medarbetare som visade att den kommersiella ELISA (Biomedica Medizinprodukte GmbH & Co KG, Wien, Österrike) gav värden som var i genomsnitt 21% (intervall 11-52%) av RIA-värdena. Korsvalidering av referensstandarden för ELISA-kit med RIA-analys visade en oenighet på 15% .

sammanfattning

mätningar av CNP och NT-proCNP påverkades troligen inte av fördröjning av provprocession eller typ av blodprov (förutom CNP i plasmaprover). För plasmaprover var endast EDTA-antikoagulerade blodprover lämpliga för CNP ELISA-analysen som användes i denna studie. Följaktligen kan koncentrationen av CNP och NT-proCNP användas i kliniska tillämpningar för att bestämma CNP-effekter. Det bör också beaktas att koncentrationen av NT-proCNP, som endast är en biprodukt av den aktiva peptiden, kan dölja CNP: s sanna natur. Skillnaden i uppmätta CNP-koncentrationer som bestäms antingen av RIA-analyser eller av ELISA-analyser är dock fortfarande oförklarlig men verkar troligen bero på metodologiska problem. Därför , som rekommenderas för ANP och BNP, måste immunanalyser för CNP också standardiseras eller harmoniseras i framtiden.