Hur man utför DNA-extraktion från torkade blodfläckar med hjälp av Chelexharts

varje bio – forskare som vill analysera DNA vet att processen börjar med extraktion av DNA från celler av intresse. Dessa celler kan vara RBC, parasiter eller bakterier för att nämna några. Dessutom finns det olika DNA-extraktionsmetoder1 att välja mellan beroende på provtyp, nedströmsanalys och så vidare. Många forskare börjar med torkade blodfläckar (DBS) och så hur man extraherar DNA från sådana prover är av särskilt intresse. En DBS framställs vanligen genom att samla blod på ett Whatman FTA card2 eller Whatman kromatografiskt 3 mm filterpapper och låta det torka under en tidsperiod (~4 timmar) före bearbetning. Denna metod för bioprovtagning har använts i årtionden.

en användbar metod för att isolera DNA från sådana prover med användning av BT Chelex 100 Resin3 beskrivs nedan.

steg ett: Erytrocytlys

• skär ut en torr blodfläck och placera den i ett mikrocentrifugrör (1,5 ml) med en hålslagare. Glöm inte att märka röret, särskilt när du arbetar med flera prover. För kvalitetskontrolländamål, inkludera också en positiv kontrollblodfläck.
• tillsätt 1 ml 0, 5% saponin i mikrocentrifugröret som innehåller blodfläcken. Stäng, virvel och inkubera vid 4 0C i minst 4 timmar, eller ännu bättre, över natten. I detta steg komplexa saponin med kolesterol i erytrocytmembranet som leder till bildandet av porer i membranet och därmed hemolys.4 Saponin är ett vanligt använt lysreagens för att frigöra parasiter (till exempel malariaparasiter) från röda blodkroppar.
• snurra i några sekunder vid 4000 rpm för att ta bort droppar från det inre locket och aspirera saponin från röret med en icke-barriärpipettspets fäst vid en pasteurpipett på en vakuummonteringsmaskin. En pasteurpipett av plast kan också användas. Lämna platsen i mikrocentrifugröret.

steg två: tvätt

• tillsätt 1 ml fosfatbuffrad saltlösning i mikrocentrifugen, stäng, virvel och inkubera vid 4 0C i 20-30 minuter. Inkubering över natten kommer inte att orsaka någon skada. Detta steg säkerställer att saponin avlägsnas från röret.
• snurra i några sekunder vid 4000 rpm och ta sedan bort PBS, på samma sätt som du tog bort saponin. Lämna platsen i mikrocentrifugröret.

steg tre: DNA-extraktion med Chelex-harts

princip: Chelex-harts fungerar genom att förhindra DNA-nedbrytning från nedbrytande enzymer (Dnaser) och från potentiella föroreningar som kan hämma nedströmsanalyser. I allmänhet kommer Chelexhartset att fälla sådana föroreningar och lämna DNA i lösning. Chelex-hartset arresterar katjoner såsom Mg2+, en viktig kofaktor för Dnasverkan, vilket skyddar DNA från nedbrytning.5,6

• pipett och tillsätt 150 oc 6,7% chelexhartslösning i mikrocentrifugröret som innehåller fläcken. Stäng röret. En viktig påminnelse: när du förbereder 6,7% Chelex-lösningen, använd vatten som är fritt från Dnaser, nukleaser (eller något som kan skada och försämra DNA).
• inkubera vid 95 0C i 10 minuter med hjälp av ett värmeblock/ shaker. Det är viktigt att öppna röret två gånger, var 2: e minut, för att frigöra tryck och skaka sedan i några sekunder därefter. Detta frigör DNA till lösning.

Steg fyra: Undvik Chelex Hartspärlor i slutligt extrakt

• snurra i 5 minuter vid 4000 rpm
• pipett så mycket extrakt som möjligt i ett mindre mikrocentrifugrör (0,6 ml) med en aerosolbarriärspets samtidigt som du undviker överföring av Chelexpärlor.
• Centrifugera 0,6 ml mikrocentrifug vid 4000 rpm i 10 minuter. Tanken med den andra spinn är att ta bort eventuella kvarvarande Chelex pärlor som kan föra över till den slutliga extraktet. Varför är detta viktigt? Två huvudorsaker: 1) Chelex binder till magnesiumjoner (essentiell kofaktor för Taq-polymeras som används i PCR) och 2) Chelex fluorescerar. Om fluorescens är ditt sätt att visualisera ett resultat kan detta skapa ett falskt positivt.
• pipett ca 100 oc och överför det slutliga extraktet till en ny mikrocentrifug. Märk och förvara i kylskåp.

några Tips medan du gör DNA-extraktioner

• arbeta i en ren miljö fri från föroreningar
• använd pipettspetsar som är fria från nukleaser
• hantera alla prover med handskar
• undvik igen Chelex-pärlor i ditt slutliga extrakt

slutsats

Chelex Resin7, ger en enkel och snabb DNA-extraktionsmetod från DBS, för användning i olika molekylära analytiska tillämpningar. Denna metod kräver inte dyr utrustning och är pålitlig när den testas mot andra metoder.

1. GE Sjukvård (2010). Tillförlitlig extraktion av DNA från Whatman FTA-kort. Ansökan Not 28-9822-22 AA. Buckinghmashire, Storbritannien: GE Healthcare.
2. Whatman (nd). Förbereda en FTA-skiva för DNA-analys. Whatman FTA protokoll BD08.
3. Bio-Rad (nd) Chelex 100 och Chelex 20 kelaterande jonbytarharts bruksanvisning. LIT200RevB. Hercules, CA: Bio – Rad laboratorier.
4. Baumann, E., Stoya, G., V Obiklkner, A., Richter, W., Lemke, C. och Linss, W. (2000). Hemolys av humana erytrocyter med saponin påverkar membranstrukturen. Acta Histokemica, 102 (1), 21-35.
5. IBRC (2016). Extraktionsprotokoll: Chelex. IBRC webbplats. Hämtad från http://ibrc-bali.org/research/protocol/
6. Kambara, CS, Boissaye, R., Stewart, J. och Staton, P. (nd). Utveckling och intern validering av ett chelex-DNA-Extraktionsprotokoll för orala kompresser.
7. Walsh, PS, Metzger, da och Higuchi, R. (2013). BioTechniques 30th Anniversary Gem Chelex 100 som ett Medium för enkel extraktion av DNA för PCR-baserad typning från rättsmedicinskt Material. Bioteknik, 54 (3), 134-139.