Hidden in plain sight–mycket riklig och varierad planktonic freshwater Chloroflexi

överflöd och mångfald av phylum Chloroflexi i sötvattensmiljöer

baserat på 16s rRNA läs överflöd från 117 metagenomer från sjöar, reservoarer och floder, representanter för phylum Chloroflexi bestod av upp till 7% av de prokaryot samhälle i epilimnion (Fig. 1a, b), dock med stora fluktuationer. I likhet med tidigare observationer dominerade CL500-11-linjen hypolimnionprover (når minst 16% i alla utom ett prov och nästan 27% i ett prov från Lake Biwa) (Fig. 1c), bortsett från en mindre känd grupp som kallas tk10-klustret. Majoriteten av tk10-relaterade 16s rRNA-sekvenser i SILVA-databasen härstammar från jord, mänsklig hud eller okända metagenomiska prover, medan endast fyra (1,5%) kommer från sötvatten (ytterligare fil 1: figur S1A).

överraskande dominerades epilimnionproverna av sekvenser anslutna till ”SL56 marine group” (upp till ca. 5% av den totala prokaryota gemenskapen). SL56-relaterade sekvenser av SILVA har återhämtats från en sötvattensjö och Global Ocean Series dataset (GOS) . GOS-provet från vilket de beskrevs är emellertid faktiskt en sötvattendataset, Lake Gatun (Panama). Det framgår tydligt av våra resultat (Fig. 1; Ytterligare fil 1: Figur S2) att detta kluster konsekvent endast finns i sjöar, reservoarer och floder men inte i den marina livsmiljön, vilket tyder på att det felaktigt har kallats en ”marin grupp.”En annan grupp av sekvenser, kallad JG30-KF-CM66, som beskrivs från olika miljöer (uranbrytningsavfall, jord, sötvatten, marinvattenkolonn och sediment), befanns företrädesvis distribueras i floder (särskilt floden Amazon) än sjöar (Fig. 1a, b), om än vid mycket låga överflöd (högst 1% av de totala prokaryoterna). Liknande överflöd hittades i det bräckta Kaspiska havet (djup 40 m och 150 m) (ytterligare fil 1: figur S2).

vi kunde dock inte hitta något stöd för närvaron av antingen SAR202-klustret eller dess sötvattensyster clade CL500-9 i alla undersökta metagenomiska dataset för sötvatten. I Marina och bräckta livsmiljöer finns SAR202 nästan uteslutande i de mörka aphotiska skikten, där de står för upp till 30% av det prokaryota samhället . Om det finns några SAR202-relaterade klader i sötvattensmiljöer, är de verkligen inte mycket rikliga eller kanske inte härstammar från vattenkolonnen i den ursprungliga rapporten (ytterligare fil 1: figur S1). Övergripande, även om relativa överflöd av Klorflexi i sötvattensepilimnia är mycket lägre än i de djupare vattnen, de är hem för en rik och utbredd samling av nya grupper.

med dessa observationer är det också uppenbart att i de vattenmiljöer som undersöks här (sötvatten, bräckt och marint) är mångfalden av Kloroflexirepresentanter väsentligt annorlunda, med sötvattenmiljöerna som har ett fylogenetiskt mer varierat sortiment av grupper än antingen bräckt eller marint. Dessutom finns det tydliga bevis för förekomsten av endast sötvattengrupper (t. ex., SL56) och Marina och bräckta endast grupper (SAR 202), som upprepar att salthalten är en barriär mot mikrobiella livsmiljöövergångar mellan sötvatten och marina ekosystem . Det är ingalunda ett oöverstigligt hinder som relativt nya övergångar från sötvatten till Marina (t.ex. sötvatten ”Ca. Metylopumilus spp.”och marine OM43 ) och omvänt (marine Pelagibacter och sötvatten LD12) har båda föreslagits. Det är dock troligt att grupperna som finns i bräckta miljöer kanske helt enkelt kan vara bättre ”primerade” för mer framgångsrika förflyttningar. Vi hittar exempel på grupper som finns i sötvatten och bräckta metagenomer (JG30-KF-CM66 och CL500-11).

de stora sötvattenkloroflexirepresentanterna

automatiserad binning av Klorflexi-relaterade kontigs från sammansättningar av varje 57 dataset som tillhör 14 olika miljöer (28 sjöar/reservoarer, 26 floder och 3 brackdataset) resulterade i segregering av 102 MAGs (metagenommonterade genomer) totalt (ytterligare Fil 2: Tabell S1). Fylogenomisk analys av MAGs med 30% eller högre fullständighet (n = 53) visar att en anmärkningsvärt hög mångfald av MAGs återhämtades från praktiskt taget alla välkända Klorflexiklasser (Fig. 2). Trettiofem MAGs utgjorde tre separata nya klassnivålinjer utan tillgängliga odlade representanter (SL56, TK10 och JG30-KF-CM66).

medan fluorescens in situ hybridisering följt av katalyserad reporteravsättning (KORTFISK) detekterade höga antal CL500-11-celler i sjön Zurich epilimnion under partiell mixis på vintern, toppöverflödesnivåer hittades alltid i djupare zoner, i båda sjön Zurich (upp till 11% av alla prokaryoter; Fig. 3a) och Lake Biwa (upp till 14%; Fig. 3d). CL500 – 11 överflöd korrelerade negativt med både temperatur och klorofyll a-koncentration (ytterligare fil 1: Figur S3). I Reservoarprover av Uzimov låg emellertid CL500 – 11 under detektionsgränsen (< 0,18%), vilket tyder på att denna relativt grunda livsmiljö (maximalt djup 43 m) inte representerar en föredragen nisch för denna grupp av bakterier (ytterligare fil 1: figur S4). CL500 – 11 celler har tidigare visualiserats av KORTFISK och visat sig vara stora, krökta celler . Liknande former och storlekar observerades i FISKPROVER från sjön Zurich med medellängder på 0,92 oc (intervall 0,4 – 1,6 oc; n = 277) och bredder på 0,28 oc (intervall 0,19–0,39 oc). Analys av cellvolymer (median 0.06 occurm3) och biomassa för detta kluster i jämförelse med alla prokaryoter (Fig. 3C) föreslår ett extremt högt bidrag från CL500 – 11-befolkningen till total mikrobiell biomassa. Deras förhållande mellan biomassa och överflöd är nästan 2, dvs vid 10% överflöd utgör de nästan 20% av den totala prokaryota biomassan, vilket indikerar en anmärkningsvärd anpassning till den relativt oligotrofa djupa hypolimnionen och uppnår höga populationer även med sina stora cellstorlekar.

vi återhämtade 11 MAGs (10 sötvatten, 1 bräckt) för CL500-11 totalt. Alla fyra MAGs av Lake Biwa från olika månader bildar en enda art. De två arterna från Lake Zurich verkar emellertid samexistera under hela året (mars, maj och November) med en art som förgrenar sig tillsammans med den tidigare beskrivna MAG från Lake Michigan (CL500-11-LM) och de andra arterna har nära representanter också i bräckt Kaspiska (> 95% ANI) och liknande metagenomiska fragment rekryteringsmönster (Fig. 2 och 4c). Vi föreslår kandidat släktet Profundisolitarius (Pro. fun.di.so.li. ta’ri.us. L. adj. profundus djup, L. adj. solitarius ensam, N. L. masc. n. Profundisolitarius en enda enstöring från djupet) inom Candidatus Profundisolitariaceae fam. nov. för CL500 – 11-klustret (klass Anaerolinea).

å andra sidan är SL56-gruppen den dominerande härstamningen i Uzimov-reservoaren (Max 1.1%), både av 16S rRNA och KORTFISKANALYSER (Fig. 1 och 3). Maximal överflöd hittades nästan alltid vid cirka 5-20 m vid temperaturer på ca. 15 C. C., vilket tyder på att denna grupp i första hand är epilimnetisk (tilläggsfil 1: figurerna S3 och S4). Denna region av vattenkolonnen (termoklin), förutom att ha en temperaturgradient, har också signifikant lägre ljusintensitet jämfört med ytskikt. Peak överflöd av svagt ljus Anpassad cyanobakterium Planktothrix rubescens på cirka 13 m djup i de stratifierade sommarprofilerna av sjön Zurich sammanfaller med maximal överflöd av SL56 (ytterligare fil 1: figur S3). SL56 celler är rod-formad och långsmal (genomsnittlig längd = 0.68 ± 0.25 µm. genomsnittlig bredd = 0.35 ± 0.09 µm; n = 6; Fig. 3e). Så vitt vi vet är detta den första rapporten från en sötvattenspecifik Kloroflexigrupp som verkar trivas i epilimnion.

totalt 14 MAGs utvanns för SL56 kluster (1 innehållande 16s rRNA) och bildar en klassnivå härstamning, avsevärt avvikande från alla kända Chloroflexi (Fig. 2). Deras enda släkting är en enda MAG (Chloroflexi CSP1-4) som beskrivs från akvifersediment . 16S rRNA-kladen till vilken CSP1 – 4 enligt uppgift ansluter sig till är Gitt-GS-136 , och majoriteten av sekvenserna i denna klad härstammar från antingen jord-eller flodsediment (information från SILVA taxonomi). Vi kunde emellertid inte upptäcka någon 16S rRNA-sekvens (partiell eller Fullständig) i den tillgängliga genomsekvensen av CSP1-4. Nästa närmaste klad (i 16S rRNA taxonomi) till Gitt-GS-136 och SL56 är KD4-96, vars sekvenser erhölls från samma livsmiljöer (se ytterligare fil 1: figur S1B). Dessutom kommer alla kända 16S rRNA-sekvenser från SL56-gruppen endast från sötvatten (Lake Gatun, Lake Zurich, etc.). Sammantaget verkar det som om de närmaste fylogenetiska släktingarna till sötvatten SL56-linjen bor i jord-eller sedimenthabitat.

SL56 MAGs rekonstruerades från geografiskt avlägsna platser (Europa, Nord-och Sydamerika, Fig. 2), och minst nio olika arter kunde detekteras (ANI, Fig. 1). Inga MAGs erhölls från Lake Biwa prover, men tre 16s rRNA sekvens hämtades i obundna contigs. De rekonstruerade MAGs är globalt fördelade längs sötvatten dataset från epilimnion (ingen detekteras i den djupa hypolimnion) (Fig. 4 och ytterligare fil 1: figur S6). Inga SL56 MAGs rekonstruerades från Kaspiska havet, och ingen av de återvunna genomen rekryterades från bräckta metagenomer. Vi föreslår kandidatsläktet Limnocylindrus (Lim.no.cy.lin ’ Drus. Gr. fem. n. limne en sjö; L. masc. n. cylindrus en cylinder; N. L. masc. n. Limnocylindrus en cylinder från en sjö) inom Limnocylindraceae fam. nov., Limnocylindrales ord.nov. och Limnocylindria classis. nov. för Chloroflexi SL56-klustret.

TK10 16s rRNA-sekvenser hittades vid högsta överflöd i Biwa-hypolimnionprover (maximalt ca. 2%) (Fig. 1a, c). Cellerna var äggformiga med en uppskattad längd av 1,08 0,1 0,1 0,84 0,09 0,09 xnumx (N = 12; Fig. 3e). Ett sammanhängande kluster av nio MAGs (tre innehållande 16s rRNA ytterligare fil 1: Figur S1) från geografiskt avlägsna platser (Europa, Asien och Nordamerika) återhämtades. Dessa anmärkningsvärt kosmopolitiska organismer som trivs i djupare sjöskikt är inte särskilt olika (ANI-värden > 95%). Denna uppenbara låg mångfald kan vara en följd av en mycket specialiserad nisch eller vad som är mer sannolikt, ett resultat av en relativt ny övergång till sötvatten, liknar ”Ca. Fonsibacter” (LD12 Alphaproteobacteria) . Inga 16S rRNA-representanter detekterades med säkerhet i Marina eller bräckta metagenomer, även om vissa 16S rRNA-sekvenser av SILVA-databasen har erhållits från marina sediment och vattenpelare (ytterligare fil 1: figur S1). Närmaste släktingar från 16s rRNA verkar vara antingen från jord eller från sedimentprover som tyder på att dessa kan vara deras ursprungliga livsmiljö. Intressant är att tk10-klustret också är djupt förgrenat, först efter SL56 och CSP1-4 i det fylogenetiska trädet av Kloroflexi i stort, och alla andra Kloroflexirepresentanter (MAGs eller isolatgenomer) verkar härstamma från en gren som skiljer sig från båda dessa. Vi föreslår kandidat släktet Umbricyclops (Um.bri.cy ’ clops. L. fem. N. umbra skugga; L. masc. n. cyclops (från Gr. Runda ögon; Cyclops) en cyclops; N. L. masc. n. Umbricyclops ett runt öga som bor i skuggan) inom Umbricyclopaceae fam. nov., Umbricyclopales ord.nov., och Umbricyclopia classis November. för denna grupp av organismer.

KORTFISKRESULTAT visar att jg30-KF-CM66-celler är sfäriska med en uppskattad diameter på 0,56 oc (0,15 oc; n = 8; Fig. 3e); emellertid observerades mycket låga proportioner (< 0,28%) för JG30-KF-CM66 i Zurich-sjön och den Usaimov Reservoardjupprofiler (ytterligare fil 1: figurerna S3 och S4). Vi erhöll 12 MAGs, mestadels från djupvattenspelaren (åtta bräckt, fyra sötvatten), en med en nästan fullständig 16S-sekvens, som bildade en ny klassnivå i fylogenomisk analys (Fig. 1). De närmaste släktingarna till dessa MAGs är marine SAR202 och Dehalococcoidea (Fig. 1 och ytterligare fil 1: figur S1). Inom detta kluster, distinkta grupper av bräckt och sötvatten MAGs kan urskiljas. Vi föreslår kandidat släktet Bathosphaera (Ba.tho.sphae ’ ra. G. adj. bathos djup; L. fem. n. sphaera en sfär; N. L. fem. n. Bathosphaera en coccoid bakterier som lever i djupet) inom Bathosphaeraceae fam. nov., Bathosphaerales ord.nov. och Bathosphaeria classis. nov. för Chloroflexi JG30-KF-CM66-klustret.

vi återhämtade också MAGs i klasserna Chloroflexia (fyra MAGs) och Caldilineae (två MAGs) (Fig. 1). Chloroflexia MAGs var relaterade till mesophilic Oscillochloris trichoides DG-6 i underordning Chloroflexineae (en MAG) och tre andra MAGs till Kouleothrix aurantiaca i Kouleotrichaceae fam. nov. att bilda en ny underordning som vi föreslår namnet Kouleothrichniae underordning. nov. Ingen av dessa MAGs visar någon betydande fragmentrekrytering bortsett från deras ursprungsort. Ytterligare 14 MAGs från Caspian anslutna till sar202-klustret som inte kommer att diskuteras vidare här som de redan har beskrivits .

bidrag av sötvattenkloroflexi i ekosystemfunktion

metaboliska insikter i de rekonstruerade Klorflexi MAGs (fullständighet 30%) föreslår en primärt heterotrofisk livsstil som i vissa grupper förstärks av ljusdriven energiproduktion via antingen rhodopsiner (CL500-11, Klorflexaler, SL56 och TK10) eller aerob anoxygen fototrofi (Klorflexaler). MAGs i varje kluster innehåller nödvändiga gener för central kolhydratmetabolism inklusive glykolys, glukoneogenes och trikarboxylsyracykel. Nyckelgener för assimilatorisk sulfatreduktion (3′-fosfoadenosin 5′-fosfosulfat (PAPS) syntas och sulfat adenylyltransferas) var frånvarande i de flesta MAGs vilket tyder på användningen av exogena reducerade svavelföreningar . Denitrifikationsgener (nitratreduktas/nitritoxidoreduktas alfa-och beta-subenheter och nitritreduktas) hittades i TK10 MAGs, men de efterföljande enzymerna som var ansvariga för produktionen av molekylärt kväve var frånvarande.

i vattenmiljöer är Thaumarchaeota och cyanobakterier huvudkällan till kobalamin och dess korrinoidprekursorer för det stora samhället av auxotrofer eller de få som kan rädda . De novo-syntes av kobalamin har en hög metabolisk kostnad, och Black Queen-hypotesen har framförts som en förklaring till varför endast ett fåtal medlemmar i samhället åtar sig sin produktion . Ingen av de rekonstruerade Chloroflexi MAGs kodar nödvändiga gener för corrin ring biosyntes från scratch, och hög affinitet kobalamin (BtuBFCD) eller andra misstänkta corrinoid (DET1174-DET1176) transportörer saknades också som kan vara en följd av genom ofullständighet eller användning av en obeskriven transportör. Men inte alla dessa organismer verkar vara auxotrofer som MAGs av JG30-KF-CM66 kluster koda gener för cobinamid till kobalamin bärgning väg som utnyttjar importerade korrinoider tillsammans med intermediärer från riboflavin biosyntes väg att syntetisera kobalamin . ZH-chloro-G3 MAG innehåller en nästan fullständig kobalamin bärgning (endast saknas CobC) och riboflavin biosyntes väg (ytterligare fil 3: Tabell S2).

flagellära monteringsgener var närvarande i flera MAGs av CL500-11 och TK10-kluster (Fig. 1 och ytterligare fil 3: Tabell S2). Emellertid saknades l-och P-ringkomponenterna som förankrar flagella till det yttre membranet i alla flagellerade MAGs och referenskloroflexi-genom (t.ex. Termomikrobium, Sphaerobacter). Dessutom kodade MAGs och referenskloroflexi–genomer inte gener för LPS-biosyntes och inga sekretionssystem, förutom Sec och Tat, detekterades (typ I-IV sekretionssystem som är förankrade i det yttre membranet saknas) (ytterligare fil 3: Tabell S2). Sammantaget stärker den jämförande genomiken av tillgängliga Klorflexi-genomer slutsatser att medan elektronmikrografer föreslår två elektrontäta lager i de flesta medlemmar av denna fylum, har Klorflexi sannolikt ett enda lipidmembran (monoderm) snarare än två (diderms) .

Rhodopsinliknande sekvenser erkändes i 18 MAGs av denna studie från representanter för CL500-11, Klorflexi, SL56 och TK10 som är fylogenetiskt närmast xanthorhodopsins (ytterligare fil 1: Figur S8A och B), och är inställda för att absorbera grönt ljus som liknar andra sötvatten-och kustnära rhodopsiner (ytterligare fil 1: figur S8C). Flera MAGs kodar gener för karotenoidbiosyntes som möjliggör en karotenoidantenn som är kännetecknet för xanthorhodopsins . Av de rester som är involverade med bindande salinixantin (den dominerande karotenoiden av Salinibacter ruber) fann vi ett överraskande högt antal konserverat (10 identiskt av 12 i minst en rhodopsin-sekvens) (ytterligare fil 1: Figur S8D), vilket tyder på att en karotenoidantenn kan vara bunden, vilket gör åtminstone några av dessa sekvenser bonafide xanthorhodopsins.

även representanter för CL500-11 och TK10 som främst finns i hypolimnion under stratifiering kan fototrofi; de kan emellertid potentiellt komma åt den fotiska zonen under vintern och tidig vårmixis. Förutom rhodopsinbaserad fotoheterotrofi hämtade vi också MAGs av klassen Klorflexi kodande gener för fotosystem typ II-reaktionscentrumproteiner L och M (pufL och pufM), bakterioklorofyll och karotenoidbiosyntes. PufM-gensekvenserna kluster tillsammans med andra Klorflexirelaterade pufM-sekvenser (ytterligare fil 1: figur S9). Emellertid hittades inga bevis för kolfixering via antingen 3-hydroxipropionatvägen eller Calvin–Benson-cykeln i något fotosystem som bär MAG vilket kan vara en följd av MAG ofullständighet. Det kan också vara så att dessa är aeroba anoxygena fototrofer som inte fixar kol, t .ex. sötvatten Gemmatimonadetes och Acidobacteria (båda aeroba).

evolutionär historia av pelagisk Kloroflexi

det framgår av de fylogenomiska analyserna att samlingen av representanter för phylum Chloroflexi som återvinns i detta arbete, tillsammans med de befintliga genomsekvenserna från isolat och MAGs, erbjuder endast en partiell skiss av den komplexa evolutionära historien för phylum i stort. Till exempel, de mest divergerande grenarna ”Ca. Limnocylindria ”(SL56 kluster) och ” Ca. Umbricyclopia” (tk10-kluster) har praktiskt taget ingen nära hud bortsett från en akvifersediment MAG (relaterad till ”Ca. Limnocylindria”). Emellertid har relaterade 16s rRNA-kloner återhämtats från jord/sediment för båda dessa grupper, vilket tyder på övergångar till en pelagisk livsstil (ytterligare fil 1: figur S1B).

Factoring frånvaron av relaterade Marina 16S rRNA-sekvenser för dessa grupper, förutom deras odetekterbarhet i Marina metagenomiska dataset föreslår också ett anor från jord/sediment snarare än saltlösningsmiljön. Även om möjligheten till ett marint ursprung inte formellt kan uteslutas, verkar riktningen för en övergång från Mark/sediment till sötvattensvattenkolonner troligen. Dessutom, med tanke på att ” Ca. Limnocylindria ” och ” Ca. Umbricyclopia ” avviker före avvikelsen mellan klasserna Dehalococcoidea och marine SAR202 (klass ”Ca. Monstramaria”), som är den enda ekologiskt relevanta Marina Klorflexi som hittills är känd (den förra i marina sediment och den senare i djuphavsvattenkolonn), är det troligt att förfädernas Klorflexi har sitt ursprung i en jord/sedimenthabitat. Framgången för marine SAR202 i de djupa oceanerna är anmärkningsvärd; det är den mest utbredda, kanske numeriskt mest rikliga Kloroflexigruppen på planeten. Men några 16s rRNA-sekvenser från sina närmaste släktingar, Dehalococcoidea, har också återhämtats från sötvattensediment, även om de allra flesta verkar vara från djupa marina sediment (båda anoxiska livsmiljöer).