antikroppar
kanin IGG (Sigma) konjugerad till Dynabeads användes mot TAP-taggade stammar där TAP-taggen innehållande Protein A var målet. Millipore 07-729 antikropp användes mot k562-prover riktade mot CTCF.
TN5 rening
en anpassad konstruktion av Tn5 E54K E110K P242A L372P14 i en pET-45B( + ) vektor beställdes (GenScript) för att uttrycka hyperaktiv Tn5 med en N-terminal His6-tagg. Plasmiden finns tillgänglig på Addgene (Addgene ID: 112112). BL21 (DE3) kompetenta E. coli-celler (New England Biolabs) transformerades och en enda koloni odlades vid 37 kg C till en OD600 av 0,4 i 500 ml LB + 50 kg/ml ampicillin + 30 kg/ml kloramfenikol. Celler överfördes till en 25 C-inkubator och inducerades med 0,5 mm isopropyl-0,5-d-galaktopyranosid i 4 timmar. cellerna uppsamlades genom centrifugering, tvättades en gång med St-buffert och cellpelleten frystes snabbt i flytande kväve.
Tn5 renades som tidigare beskrivet10, med få modifieringar. I korthet resuspenderades celler i 10 volymer (ml/g) Tegx100-buffert (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0.1% Triton-X 100) innehållande KPI och 100 oc rylmetylsulfonylfluorid och lyserades genom inkubation med lysozym (Sigma; 1 mg / 1 g cellpellet) vid rumstemperatur i 30 min. Lysatet centrifugerades vid 20,000 xnumx kg för 20 min vid 4 xnumx C, och supernatanten utfälldes med 0,25% polyeteneimin (Sigma) och centrifugerades vid 10,000 xnumx g för 15 min. Supernatanten utfälldes sedan med 47% mättnad ammoniumsulfat (0.28 g/ml) under en 30 min inkubation, och centrifugerades sedan vid 20.000 kcal g för 15 min.
pelleten återsuspenderades sedan i 50 ml Nickelaffinitetsbelastningsbuffert (50 mm kaliumfosfat, pH 7,4, 50 mM KCl, 20% glycerol) och laddades på en HisTrap HP-kolonn (GE Healthcare; 5 ml) vid 1,5 ml/min jämvikt med samma buffert. Kolonnen tvättades sekventiellt med tvättbuffert I (50 mM kaliumfosfat, pH 7,4, 1 M KCl, 50 mM imidazol, 20% glycerol), tvättbuffert II (50 mM kaliumfosfat, pH 7.4 500 mM KCl, 50 mM imidazol, 20% glycerol) och sedan eluerades Tn5 med Nickelaffinitetselueringsbuffert (50 mM kaliumfosfat, pH 7, 4 500 mM KCl, 500 mM imidazol, 20% glycerol) vid 2 ml/min. Eluatet späddes till 300 mM KCl med Utspädningsbuffert (50 mM kaliumfosfat, pH 7,4, 20% glycerol) och den slutliga volymen justerades till 50 ml med TEGX300-buffert (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0,1% Triton-X 100).
därefter laddades provet på en HITRAP Heparin HP-kolumn (GE Healthcare; 1 ml) jämvikts med TEGX300 vid 1 ml/min. Efter tvättning med 5 kolonnvolymer buffert kördes en 10 ml linjär (300 mM till 1,2 M) NaCl-gradient för att eluera. Tn5 eluerad från kolonnen vid ca 600 mM NaCl. Fraktioner innehållande huvudulationstoppen kombinerades (3,5 ml) och dialyserades över natten mot Tegx300-buffert innehållande 30% glycerol och lagrades sedan vid -80 C. C.
Jästkromatinpreparat
TAP-märkta Saccharomyces cerevisiae-stammar (öppna biosystem) odlades i 500 ml jästpeptondextrosmedia till en OD600 = 0,8 vid 25 C. Cellerna var tvärbundna med formaldehyd vid en slutlig koncentration av 1% för 15 min vid rumstemperatur och släcktes med en slutlig koncentration av 125 mM glycin för 5 min. Celler uppsamlades genom centrifugering och tvättades i 1 ml ST-buffert (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl) vid 4 c c och delades upp i två alikvoter. Cellerna pelleterades igen, supernatanten avlägsnades och pelleten var flashfryst.
en 250 ml kultur alikvot lyserades i 750 occyl av FA Lysis buffert (50 mm Hepes-KOH, pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton, 0.1% natriumdeoxikolat, och CPI) och 1 ml volym av 0,5 mm zirkoniumoxid/kiseldioxid pärlor genom pärla slå i en Mini-Beadbeater-96 maskin (Biospec) för tre cykler av 3 min på/5 min off cykler (prover hölls på is under off cykeln). Lysatet överfördes till ett nytt rör och mikrocentrifugerades med maximal hastighet i 3 min vid 4 c-c för att pelletsera kromatinet. Supernatanten kastades bort och pelleten återsuspenderades i 750 oc-l FA-Lysbuffert kompletterad med 0,1% SDS och överfördes till ett 15 ml polystyren koniskt rör. Provet sonikerades sedan i en Bioruptor (Diagenod) för 15 cykler med 30 s på/av-intervall för att erhålla DNA-fragment 100 till 500 bp i storlek. En ChIP-exo-analys behandlade ekvivalenten av 50 ml cellodling (~6 108-celler i 108-celler). Detta representerar ett bekvämt belopp snarare än ett minimibelopp som behövs.
k562 kromatinpreparat
humana kroniska myelogena leukemiceller (K562, ATCC) bibehölls mellan 1 105 och 1 106 106-celler/ml i DMEM-media kompletterat med 10% fetalt bovint serum vid 37 C med 5% CO2. Celler tvättades med PBS (8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 150 mM NaCl och 2,7 mM KCl), sedan tvärbunden med formaldehyd vid en slutlig koncentration av 1% för 10 min vid rumstemperatur och släcktes med en slutlig koncentration av 125 mM glycin för 5 min. Supernatanten avlägsnades och cellerna resuspenderades i 1 ml PBS för att tvätta. Celler alikvoterades för att innehålla 100 miljoner celler, centrifugerades, supernatanten avlägsnades och pelleten frystes snabbt.
en alikvot på 100 miljoner celler (för användning i flera ChIPs) lyserades i 500 kubl (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0.5% NP40 och komplett proteashämmare (CPI, Roche)) genom inkubering på IS i 10 minuter. Lysatet mikrocentrifugerades vid 2500 rpm i 5 minuter vid 4 msk C. supernatanten avlägsnades, pelleten resuspenderades i 1 ml (50 mM Tris-pH 8,0, 10 mm EDTA, 0,32% SDS och CPI) och inkuberades på IS i 10 minuter för att lysera kärnorna. Provet späddes med 600 oc-l immunutspädningsbuffert (IP-Utspädningsbuffert: 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mm EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 och KPI) till en slutlig koncentration av (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 7 mM EDTA, 56 mM NaCl, 0,4% Triton-X 100, 0.2% SDS, och KPI), och sonicated med en Bioruptor (Diagenode) för 10 cykler med 30 s på/av intervall för att erhålla DNA-fragment 100 till 500 bp i storlek.
Musvävnadspreparat
16 veckor gammal vuxen manlig mus hjärna, lunga, lever och njurvävnader tillhandahölls generöst av Dr.Yanming Wang Musvävnader bearbetades vid 100 mg och kromatin genererades som tidigare beskrivet21 med mindre modifieringar. I korthet maldes 100 mg musvävnad i bitar på is, fixerades med 1% formaldehyd i 10 minuter och släcktes sedan med en slutlig koncentration av 125 mM glycin i 5 minuter. Celler snurrades, tvättades med PBS och resuspenderades sedan i 1 mL kall Farnham-celllysbuffert (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 0,5% Triton X-100 och KPI). Celler inkuberades sedan på en rototorque i 20 minuter vid 4 C. isolerade kärnor isolerades genom att spinnas ner och resuspenderas i RIPA-kärnlysbuffert (1 msk PBS, 1% NP-40, 0,5% Nadeoxikolat, 0,5% SDS och KPI). Kärnor sonicerades sedan med en Bioruptor (Diagenode) för 10 cykler med 30 s på/av intervall för att generera DNA i 100-500 bp storleksintervall. Levercellantal uppskattades som tidigare beskrivna22, med användning av en omvandlingsfaktor på 1 mg vävnads våtvikt motsvarar ~250 000 celler.
Kromatinimmunutfällning
en 50 ml odlingsekvivalent av jäst eller 10 miljoner cellekvivalent av k562 kromatin späddes till 200 oc med IP-Utspädningsbuffert och inkuberades över natten vid 4 oc C med lämplig antikropp. En 10 oc-l bäddvolym av IGG-Dynabeads tillsattes till jästproverna; och 3 occurg av anti-CTCF-antikropp med en 10 occurl slurry-ekvivalent av Protein A Mag Sepharose (GE Healthcare) tillsattes till k562-proverna.
ChIP-exo 1.1
ChIP-exo 1.1 utfördes som tidigare beskrivt7,8,23. I korthet utfördes följande enzymatiska steg med immunoprecipiterat kromatin fortfarande på hartset med flera salttvättar mellan varje steg: T4-DNA-polymerasändpolering, T4-polynukleotidkinas, Klenow-fragment A-tailing, T4-DNA-ligasmedierad read_2-adapterligering, phi29-DNA-polymerasfyllning, andra T4-polynukleotidkinas, lambda-exonukleas-digestion och RecJf-exonukleas-digestion. Efter omvänd tvärbindning över natten och Proteinas k-behandling utfördes följande steg i lösning: phi29 primerförlängning, andra Klenow-fragment A-tailing, T4-DNA-ligasmedierad read_1-adapterligering och PCR.
ChIP-exo 3.0 och 3.1 (tagmenteringsbaserad version)
efter immunutfällning utfördes följande steg på hartset. För att montera Transposas inkuberades Tn5 i en Transposasblandning på 10 kg innehållande följande komponenter och inkuberades i 30 minuter vid rumstemperatur: 12,5 kg TN5, 50% glycerol och 7,5 kg adapter (NexA2/ME comp). Se kompletterande Tabell 1 för oligonukleotidsekvenser som används i denna studie.
Chipmaterialet på harts tvättades sekventiellt med FA Lysbuffert, NaCl-buffert (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton-X 100, 0.1% natriumdeoxikolat), LiCl-buffert (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM LiCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoxikolat), och 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 vid 4 kcal C.
taggmenteringsreaktionen (30 kg) innehållande: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10% dimetylformamid och 1 tagmenteringsblandning från steg 1 (slutlig koncentration: 1,25 oc TN5, 5% glycerol, 750 nm adapter) inkuberades för 30 min vid 37 oc C. efter inkubation tvättades hartset två gånger med guanidinhydrokloridbuffert (50 mm tris-HCL, Ph 7,5, 500 mm Guanidinhydroklorid, 2 mm EDTA, 1% Triton-X 100, 0.1% natrium deoxicholat) för 5 min vid 37 °C, sedan en gång till med LiCl Buffert och 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 vid 4 °C.
fyll i reaktion (30 µl) innehåller: 10 U phi29-polymeras (NEB), 1 × phi29 reaktion buffert (NEB), 2 × (200 µg/ml) BSA, och 165 µM dntp var inkuberas i 20 min vid 30 °C, sedan tvättas med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 vid 4 °C. kinas reaktion (30 µl) innehåller: 10 U T4 PNK (NEB), 1 × T4 DNA Ligase Buffert (NEB), och 2 × BSA var inkuberas i 15 min vid 37 °C, sedan tvättas med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 vid 4 °C. λ exonuclease rötning (100 mikroliter) innehåller: 20 U λ exonuclease (NEB), 1 × λ exonuclease reaktion buffert (NEB), 0.1% Triton X 100, och 5% DMSO var inkuberas i 30 min vid 37 °C, sedan tvättas med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 vid 4 °C. RecJf exonuclease rötning (100 mikroliter) innehåller: 75 U RecJf exonuclease (NEB), 2 × NEBuffer 2, 0.1% Triton X 100, och 5% DMSO var inkuberas i 30 min vid 37 °C; sedan tvättas med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 vid 4 °C.
DNA var elueras från harts, och omvänd korsbindningar och Proteinas K behandling utfördes (40 µl) innehåller: 30 µg Proteinas K, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mm EDTA, 200 mM NaCl och 0,5% SDS inkuberades i 16 timmar vid 65 kg C. supernatanten överfördes sedan till ett nytt rör och renades med Agencourt AMPure magnetiska pärlor (Beckman Coulter) enligt tillverkarens instruktioner och med användning av 1,8 kg volym AMPure slurry tillsatt till DNA-volymen (72 kg).Provet eluerades från Ampurpärlorna i 10 occyl vatten, och följande enzymatiska steg utfördes i lösning.
Adapterligering (version 3.0): för primerförlängningsreaktionen (total reaktionsvolym 20 oC-l); till återgrumlat prov inkom 1 × phi29 reaktion buffert, 2 × BSA, 100 µM dntp, och 0,5 µM MIG sekvens oligonukleotida (totalt 9 µl) och inkuberas i 5 minuter vid 95 °C, sedan 10 min på 45 °C för att möjliggöra oligo tid att para. Provet flyttades till 30 °C före tillsats av 10 U phi29-polymeras (1 µl) och ruvande i 20 min vid 30 °C, sedan i 10 minuter vid 65 °C för att inaktivera, och flyttade till 37 °C.
För A-svans reaktion (totalt reaktion volym 30 µl); att primern förlängning reaktion var extra 10 U Klenow Fragment, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, 100 µM dATP (totalt 10 µl) och inkuberas i 30 min vid 37 °C, för att sedan i 20 min på 75 °C för att inaktivera och flyttas till 25 °C. För andra adaptern ligering reaktion (totalt reaktion volym 40 µl); A-tailing reaktion var läggas till 2,000 U T4 DNA ligase (enzymatics), 1 × NEBNext Snabb Ligering Buffert (NEB), 375 nM adapter (ExA1-58/13) och inkuberas under 1 h vid 25 °C.
Skena ligering (version 3.1): för adapter ligering (40 µl); till det resuspenderade DNA tillsattes 1,200 U T4 DNA-ligas, 1 xnumx xnumx xnumx xnumx nM-adapter (ExA1-58 / ExA1-SSL_N5) och inkuberades i 1 h vid 25 xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx xnumx x Provet förstärktes sedan via PCR. För PCR-amplifiering (total reaktionsvolym 40 occl); till det resuspenderade DNA tillsattes 2 U-Phusion Hot Start-polymeras (Thermo scientific), 1 occusion HF-buffert (Thermo scientific), 200 occusionm dNTPs, 500 nM varje primer (P1.3 och NexA2-iNN) och förstärkt i 18 cykler (20 s vid 98 C C denaturering, 1 min vid 52 c c glödgning och 1 min vid 72 C C förlängning). En fjärdedel av reaktionen förstärktes under ytterligare sex cykler (24 totalt) och närvaron av bibliotek bestämdes genom elektrofores på en 2% agarosgel.
storleksval: 200-500 BP PCR-produkter renades gel från en 2% agarosgel med QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
ChIP-exo 4.0 och 4.1 (enkelsträngade DNA-ligeringsversioner)
efter immunutfällning utfördes följande steg på hartset. ChIP material på harts spolades jämfört med föregående kvartal med FA lyseringsbuffert, NaCl Buffert, LiCl Buffert, och 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 vid 4 °C. slutet reparation reaktion (50 µl) innehåller: 7.5 U T4 DNA-polymeras (NEB), 2,5 U DNA-Polymeras I (NEB), 25 U T4 PNK, 1 × T4 DNA Ligase Buffert, och 390 µM dntp var inkubera i 30 minuter vid 12 °C, sedan tvättas med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 vid 4 °C. λ exonuclease rötning (100 mikroliter)innehåller: 20 U λ exonuclease, 1 × λ exonuclease reaktion buffert, 0.1% Triton X 100, och 5% DMSO var inkuberas i 30 min vid 37 °C, sedan tvättas med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 vid 4 °C. RecJf exonuclease rötning (100 mikroliter)innehåller: 75 U RecJf exonuclease, 2 × NEBuffer 2, 0.1% Triton X 100, och 5% DMSO swas inkuberas i 30 min vid 37 °C, sedan tvättas med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 vid 4 °C.
Första adapter ligering: ssDNA ligering (version 4.0, 40 µl): för adapterion ligering 1200 U T4 DNA ligase, 1 × T4 DNA Ligase Buffert, och 375 nM enda strand adapter (ExA1-58-N5) var inkuberas under 1 h vid 25 °C, sedan tvättas med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 vid 4 °C.
Skena ligering (version 4.1, 40 µl): 1200 U T4 DNA ligase, 1 × T4 DNA Ligase Buffert, och 375 nM adapter (ExA2.1-N5/ExA2.1-20) var inkuberas under 1 h vid 25 °C, sedan tvättas med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 vid 4 °C.
Både version 4.0 och 4.1: DNA var elueras från harts, och omvänd korsbindningar och Proteinas K behandling utfördes (40 µl) innehåller: 30 µg Proteinas K, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl, och 0,5% SDS inkuberas i 16 h 65 °C.
supernatanten överfördes sedan till ett nytt rör och renades med Agencourt AMPure magnetic beads (Beckman Coulter) enligt tillverkarens instruktioner (1.8-volym). Provet eluerades från Ampurpärlorna i 20 occyl vatten, och följande enzymatiska steg utfördes i lösning.
andra adapterligering: ssDNA-ligering( version 4.0, total reaktionsvolym 40 occl): till det resuspenderade DNA tillsattes 1200 U T4-DNA-ligas, 1 oc T4-DNA-Ligasbuffert, 375 nM-adapter (ExA2.1-N5/ExA2.1-20) och inkuberades i 1 h vid 25 oC C.
Splintadapterligering (version 4.1, total reaktionsvolym 40 oC): till det resuspenderade DNA tillsattes 1200 U T4-DNA-ligas, 1 oc T4-DNA-Ligasbuffert, 375 nM-adapter (ExA1-58/ExA1-SSL_N5) och inkuberades i 1 h vid 25 oC C.
både version 4.0 och 4.1: ligeringsreaktionen renades sedan med ampurpärlor (1,8 kg i volym) och Resuspenderas i 15 ml vatten. Provet förstärktes sedan via PCR. För PCR-amplifiering (Total reaktionsvolym 40 occl); till det resuspenderade DNA tillsattes 2 U-Phusion Hot Start-polymeras (Thermo scientific), 1 ACC-Phusion HF-buffert (Thermo scientific), 200 ACC-m dNTPs, 500 nM vardera primer (P1.3 och NexA2-iNN) och förstärktes i 18 cykler (20 s vid 98 C-denaturering, 1 min vid 52 C-glödgning, 1 min vid 72 C-förlängning). En fjärdedel av reaktionen förstärktes under ytterligare sex cykler (24 totalt) och närvaron av bibliotek bestämdes genom elektrofores på en 2% agarosgel. Storleksval: 200 till 500 BP PCR-produkter renades gel från en 2% agarosgel med QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
Obs: ChIP-exo 4.0 / 4.1 införlivade en universell read_2-adapter, med streckkoden tillagd senare under PCR med långa primers. När långa PCR-primrar användes i en bibliotekskonstruktion som involverade lambda-exonukleasmältning LED biblioteken av låg avkastning och hög adapterdimerer. Vi använder nu bara fullängdsadaptrar och PCR-primers med minsta längd.
ChIP-exo 5.0
efter immunutfällning utfördes följande steg på hartset. ChIP material på harts spolades jämfört med föregående kvartal med FA lyseringsbuffert, NaCl Buffert, LiCl Buffert, och 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 vid 4 °C. För A-svans reaktion (50 µl) innehåller: 15 U Klenow Fragment, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, och 100 µM dATP var inkuberas i 30 min vid 37 °C, sedan tvättas med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 vid 4 °C. Den första adapter ligering och kinas reaktioner (45 µl) innehåller: 1200 U T4 DNA ligase, 10 U T4 PNK, 1 × NEBNext Snabb Ligering Buffert, och 375 nM adapter (ExA2_iNN / ExA2B) var inkuberas under 1 h vid 25 °C, sedan tvättas med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 vid 4 °C. Fyll i reaktion (40 µl) innehåller: 10 U phi29-polymeras, 1 × phi29 reaktion buffert, 2 × BSA, och 180 µM dntp var inkuberas i 20 min vid 30 °C, sedan tvättas med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 vid 4 °C. λ exonuclease rötning (50 µl) innehåller: 10 U λ exonuclease, 1 × λ exonuclease reaktion buffert, 0.1% Triton X 100, och 5% DMSO var inkuberas i 30 min vid 37 °C; sedan tvättas med 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 vid 4 °C.
DNA var elueras från harts, och omvänd korsbindningar och Proteinas K behandling utfördes (40 µl) som innehåller: 30 oc Proteinase K, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl och 0,5% SDS inkuberades i 16 timmar vid 65 oc C. supernatanten överfördes sedan till ett nytt rör och renades med Agencourt AMPure magnetiska pärlor (Beckman Coulter) enligt tillverkarens anvisningar (1,8 oc-volym).Provet eluerades från Ampurpärlorna i 20 occyl vatten, och följande enzymatiska steg utfördes i lösning. För andra adapterligering (Total reaktionsvolym 40 occl): till det resuspenderade DNA tillsattes 1200 U T4-DNA-ligas, 1 msk T4 – DNA-Ligasbuffert, 375 nM-adapter (ExA1-58/ExA1-SSL_N5) och inkuberades i 1 h vid 25 kg C. ligeringsreaktionen renades sedan med Ampurpärlor (1,8 kg volym) och resuspenderades i 15 kg vatten.
provet förstärktes sedan via PCR. För PCR-amplifiering (total reaktionsvolym 40 occl); till det resuspenderade DNA tillsattes 2 U-Phusion Hot Start-polymeras (Thermo scientific), 1 occusion HF-buffert (Thermo scientific), 200 occusionm dNTPs, 500 nM varje primer (P1.3 och P2.1) och amplifieras för 18 cykler (20 s vid 98 C C denaturering, 1 min vid 52 c c glödgning, 1 min vid 72 c c förlängning). En fjärdedel av reaktionen förstärktes under ytterligare sex cykler (24 totalt) och närvaron av bibliotek bestämdes genom elektrofores på en 2% agarosgel. Storleksval: 200 till 500 BP PCR-produkter renades gel från en 2% agarosgel med QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
notera: Vi har funnit att användning av en annan metod än gelrening i detta skede leder till en oacceptabelt hög nivå av adapterdimerer i det slutliga provet. Gelrening kan effektivt separera adaptern dimer (150 bp-fragment) och mindre fragment av ChIP-exo-biblioteket (200 bp-fragment = 150 BP-Adaptrar + 50 bp-insats).
DNA-sekvensering
DNA-sekvensering med hög genomströmning utfördes med en NextSeq 500 i parat slutläge som producerar 2 20 BP-avläsningar. Sekvensläsningar anpassades därefter till jäst (sacCer3) och humana (hg19)genom med användning av bwa-mem (v0.7.9 a) 24. Justerade läsningar filtrerades för att ta bort icke-unika justeringar och PCR-dubbletter. PCR-dubbletter definierades som sekvensläsningar med identiska read_1-och Read_2-sekvenser.
datatillgänglighet
alla sekvenseringsfiler och toppfiler från denna studie finns tillgängliga på NCBI genuttryck Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) under anslutningsnummer GSE110681 och GSE114606. Koordinatfiler, skriptparametrar och anpassad kod som används för att generera siffrorna för detta papper kan laddas ner från: https://github.com/CEGRcode/2018-Rossi_NatureCommunications.
alla andra data är tillgängliga från författarna på rimlig begäran.