Bakgrund: kronisk lymfocytisk leukemi (CLL) har en klassisk immunofenotyp, bestående av lätt kedjebegränsning, CD5+, CD19+, dim CD20, CD23+, CD43+, CD200+, CD10 – och CD79b-. Detta skiljer det från normala B-celler och andra lymfoproliferativa störningar (LPD). Antikroppar riktade mot dessa antigener ingår i två 8-färgflödescytometripaneler som utvecklats av Euroflow-konsortiet för arbetet med B-cell LPD. Att kombinera dessa antikroppar i en 10-färgpanel skulle vara mer kostnadseffektivt. Vidare kan nya CLL-terapier inducera djupa remissioner, vilket skapar en ökande efterfrågan för att mäta minimal restsjukdom (MRD), definierad som att ha över 1 kvarvarande leukemisk cell per 10 000 leukocyter (10-4). Den nuvarande internationella standardiserade metoden för mätning av MRD som fastställts av European Research Initiative on CLL (ERIC) använder en panel av antikroppar riktade mot CD3, CD5, CD19, CD20, CD22, CD43, CD79b och CD81. Dessa antikropp-fluorokromkombinationer skiljer sig emellertid från de som används av euroflow-diagnospanelerna. Således skulle laboratorier som överväger att genomföra MRD-testning behöva köpa antikroppar för 3 olika paneler (2 diagnostiska och 1 MRD). Vi utvidgade Euroflow-8-färglymfocytscreeningröret (LST) till att inkludera CD200 och CD23, så att CLL kan detekteras i ett 10-färgrör, vid nivåer så låga som 0.01%. Målet med denna studie var att bestämma de potentiella kostnadsbesparingarna vid implementeringen av denna nya panel och att avgöra om den är känslig nog för att upptäcka MRD.
metoder: vi beräknade antalet prover som analyserades med vårt modifierade 10-färg lst-rör (mlst1, erhållet lyofiliserat) från April 2018 till mars 2019 för att utesluta en LPD och antalet antikropp alikvoter sparade med detta tillvägagångssätt jämfört med standard 2-rör Euroflow-metoden. Vi skapade också en version av ovan nämnda panel (mLST2) med flytande antikroppar för att öka generaliserbarheten av våra resultat och ersätta CD38 med CD43 för att se om denna förbättrade MRD-detektering (se paneler nedan). För MRD-testning använde vi CLL-prover från 24 olika patienter för att producera 60 MRD-prover vid olika koncentrationer av leukemiska celler. Prover framställdes genom att spika CLL-celler i suspensioner av normala leukocyter vid ungefärliga koncentrationer av 0,1%, 0,01% och 0,001%. Varje prov alikvoterades och färgades med de tre panelerna: ERIC, mLST1 och mLST2. Data förvärvades med hjälp av en BD FACSCanto II eller en BD FACSAria-Fusion och analyserades med BD FACSDiva-programvara. CLL-celler identifierades baserat på differentiellt uttryck av nyckelmarkörer och MRD beräknades som antalet CLL-celler/totala leukocyter. MRD-positivitet definierades som 0,01% av 0,01. Överenskommelse mellan panelerna bedömdes med Bland-Altman-plottmetoden. Vi beräknade också den procentuella överenskommelsen mellan panelerna för att identifiera MRD-positivitet.
resultat: på 1 år utfördes mLST1 på 474 prover, av dessa 220 hade en LPD och 123 (56%) hade en klassisk CLL-fenotyp, vilket undanröjde behovet av ytterligare testning. Detta resulterade i nettobesparingar av 476 antikropp alikvoter. För MRD-bedömning var differentiellt uttryck av CD5 och CD20 de viktigaste bidragsgivarna för att skilja CLL från normala B-celler med mlst1 och mLST2. Vi identifierade ett CLL-fall med en atypisk immunofenotyp (dim CD5, bright CD20) som visade sig vara svårt att Grinda med en mlst-panel. MLST-panelerna och ERIC-panelen var överens om resultaten av MRD. För värden över kvantifieringsgränsen var 95% – gränsen för överenskommelse 0,3369-logg för ERIC vs mLST1-jämförelsen och 0,3485-logg för ERIC vs mLST2-jämförelsen. Således var variationen i MRD-nivåer mellan panelerna mindre än 2 gånger större delen av tiden, vilket vi ansåg kliniskt acceptabelt eftersom MRD mäts i exponentiell skala. ERIC-panelen och mlst1 hade 88,3% överenskommelse när det gäller att skilja MRD-positiva kontra MRD-negativa prover. Avtalet var 93,3% mellan ERIC-panelen och mlst2.
slutsatser: att använda en modifierad 10-färg lst-panel för både diagnos och MRD-mätning av CLL är möjlig. Fördelarna är ökad förtrogenhet med antikropparna och potentiella kostnadsbesparingar, vilket gör MRD tillgängligt för fler cytometrilaboratorier. Atypiska CLL-fall utan den vanliga CD5-positiviteten och dim CD20 är mycket svåra att Grinda med en LST-panel. I dessa fall är ERIC-panelen klart överlägsen eftersom CD22, CD79b, CD81 och CD43 fortfarande kan ge separation mellan de maligna och normala lymfocyterna.
Bazinet: BD Biosciences: Övrigt: tillhandahöll en betydande mängd antikroppar som används i detta projekt utan kostnad.. Wever: Teva Kanada Innovation: Sysselsättning. Gimmig: BD Biosciences: sysselsättning. Johnson: Lundbeck: anställning, Honoraria, medlemskap i en företags styrelse eller rådgivande utskott, andra: researvode, gåvor och andra, forskningsfinansiering; Merck: konsultation, Honoraria; Roche: konsultation, anställning, Honoraria, medlemskap i en företags styrelse eller rådgivande utskott, andra: researvode, gåvor och andra, forskningsfinansiering; Abbvie: konsultation, anställning, Honoraria, medlemskap i en företags styrelse eller rådgivande utskott, forskningsfinansiering; BD Biosciences: andra: Tillhandahöll en betydande del av antikropparna som användes i detta projekt utan kostnad.; BMS: konsultation, Honoraria; Seattle genetik: Honoraria.