En översikt över Kemogenetik

på grund av betydande utveckling inom neurovetenskapstekniker kan forskare nu selektivt utnyttja neurala system i medvetna djur genom nya metoder som kallas kemogenetik och optogenetik. Dessa metoder hjälper till att utforska de neurala kretsarna som ligger bakom invecklade beteenden i sjukdom och hälsa.

Kemogenetik och optogenetik visar likheter i deras tillvägagångssätt för att modifiera neuronal aktivitet; till exempel, i båda teknikerna, jonkanaler eller konstruerade receptorer måste introduceras i speciella hjärnregioner, genom plasmiduttryck eller virala vektorsystem. I optogenetik måste bakteriella ljuskänsliga jonkanaler uttryckas och fiberoptik måste också därefter användas för att hämma eller aktivera neuronal aktivitet in vivo eller in vitro (Boyden et al., 2005; Zhang et al., 2007).

även om denna metod erbjuder överlägsen tidsmässig kontroll av in vivo neuronal aktivitet, är den känd för att vara inneboende invasiv och behöver cerebral implantation av fiberoptik. Kemogenetik, å andra sidan, behöver inte ett kroniskt implantat men upprätthåller potentialen att kontrollera neuronal aktivitet. Detta åstadkommes genom att administrera ligander, selektiva för jonkanaler eller konstruerade receptorer, vilka annars är inerta (Armbruster et al., 2007; Campbell & Marchant, 2018). Tabell 1 visar huvuddragen i kemogenetik och optogenetik.

Tabell 1. Kemogenetik vs optogenetik

historia och utveckling

RASSLs

Kemogenetik avser användningen av jonkanaler eller genetiskt konstruerade receptorer och de selektiva ligander som aktiverar dessa receptorer för att underlätta manipulering av neuronal aktivitet. I detta sammanhang har G-proteinkopplade receptorer (GPCR) gått i spetsen för utvecklingen av kemogenetik, och det ursprungliga papperet som definierar GPCR som endast reagerar på syntetiska ligander publicerades 1998.

dessa receptorer-kända som receptorer aktiverade enbart av en syntetisk Ligand (RASSLs) — applicerades effektivt in vivo, till exempel för att fjärrstyra hjärtaktiviteten. Trots detta faktum har tillämpningen av RASSLs i neurovetenskap begränsats av den endogena aktiviteten hos receptorer i frånvaro av deras speciella ligand och den farmakologiska aktiviteten hos ligander in vivo (Coward et al., 1998; Sternson & Roth, 2014).

DREADDs

de senaste åren har utvecklingen av Designerreceptorer uteslutande aktiverats av designerdroger (DREADDS). Muterade humana muskarinreceptorer stimulerade endast av inerta ligander var de första DREADDS som utvecklades (Armbruster et al., 2007). Genom flera omgångar av mutagenes och screening mot den biologiskt inerta liganden clozapin N-oxid (CNO) identifierades muskarinreceptorer kopplade till GAQ intracellulära signalvägen.

receptorer kopplade till denna väg kan aktivera neuronal aktivitet som svar på CNO. Låga koncentrationer av CNO aktiverar alla tre Gaq-DREADDs-hM1Dq, hM3Dq och hM5Dq (Roth, 2016). Dessutom avslöjade samma studie att hM4Di och hM2Di kan hämma neuronal aktivitet via deras koppling till Gai intracellulära signalvägar. Dessa hämmande DREADDs svarar också på CNO (Armbruster et al., 2007; Figur 1).

Figur 1. Verkningsmekanism för DREADD ligands. Bindning av DREADD-ligander till Gaq-DREADDs provocerar neuronal avfyring, medan bindning till Gai-DREADDs resulterar i hämning av neuronal aktivitet. Clozapin N-oxid dihydroklorid och DREADD agonist 21 är icke-selektiva muskarin DREADD agonister och så kan aktivera eller hämma neuronal aktivitet, beroende på den specifika receptorn uttrycks. Salvinorin B är selektiv för KORD-receptorn, som är kopplad till GaI-signalering, följaktligen resulterar bindning i hämning av neuronal aktivitet. Bild kredit: Tocris Bioscience

bindningen mellan Gaq-DREADDs och CNO orsakar stimulering av fosfolipas C (PLC), som katalyserar omvandlingen av fosfatidylinositol 4,5-bisfosfat (PIP2) till 1,2-diacylglycerol (DAG) och inositol 1,4,5-trisfosfat (IP3). Både dag och IP3 har andra budbärarfunktioner: den senare binder till dess receptorer för att utlösa frisättningen av Ca2+ från intracellulära butiker, medan den förra stimulerar olika former av proteinkinas C (PKC).

bindningen mellan Gai-DREADDs och CNO orsakar hämning av adenylylcyklas (AC), vilket resulterar i minskade intracellulära cAMP-nivåer. Eftersom både EPAC och proteinkinas a (PKA) aktiveras av cAMP, hämmar CNO: s verkan vid Gai-DREADDs EPAC och PKA nedströms signalering (se Figur 1).

CNO är en metabolit av klozapin, studier tyder på att detta är en dubbelriktad omvandling och att CNO kan genomgå omvänd metabolism till klozapin. När CNO administreras i de koncentrationer som behövs för att aktivera DREADDs, kan clozapin därefter Aktivera endogena receptorer (Gomez et al., 2017). Clozapin-en atypisk antipsykotisk-verkar vid en rad mål och leder till många olika beteendeeffekter.

råttor, möss, människor, icke-mänskliga primater och marsvin visar alla den reversibla metabolismen av CNO till clozapin (Gomez et al., 2017; Manvich et al., 2018). Som ett resultat av potentiell omvänd metabolism av CNO har struktur-aktivitetsrelationsstudier utvecklats för att utveckla stabila, alternativa ligander.

den potenta DREADD ligand-DREADD agonist 21-analyserades initialt för aktivitet mot hM3Dq. Det godkända läkemedlet perlapine identifierades som en kraftfull hM3Dq-agonist i samma forskning. I Japan har detta läkemedel godkänts som lugnande och hypnotisk (Chen et al., 2015). Både perlapin och DREADD agonist 21 har därefter visat sig vara potenta agonister av hM4Di, hM3Dq och hM1Dq med liten eller ingen off-target-aktivitet. Dessutom har DREADD agonist 21 testats in vivo, där det har visats aktivera hM3Dq-Uttryckande neuroner och hämma aktiviteten hos hM4Di-Uttryckande neuroner (Thompson et al., 2018).

efter utvecklingen av muskariniska DREADDs har en hämmande DREADD skapats från Bisexuell-opioidreceptorn (KORD). Aktivering av denna hämmande DREADD uppnås genom bindning av liganden Salvinorin B, vilket resulterar i inhibering av neuronal aktivitet genom Gai-signalering. För att möjliggöra dubbelriktad kontroll av neuronal aktivitet kan KORD användas tillsammans med att aktivera DREADDs som hM3Dq (Vardy et al., 2015).

några vanliga funktioner i alla DREADDs gör dem lämpliga för tillämpning i neurovetenskapliga experiment. För det första uppvisar DREADDs inget svar på endogena ligander på grund av genetiska mutationer inom deras ligandbindningsställen som eliminerar bindning, vilket innebär att någon aktivitet av DREADD bara kommer att bero på tillämpningarna av den specifika DREADD-liganden. För det andra har in vitro eller in vivo uttryck av DREADDs ingen inverkan på baslinjebeteenden, neuronal funktion eller cellulär aktivitet före tillsatsen av DREADD-liganden (Sternson & Roth, 2014).

PSAMs / PSEMs

medan DREADDs och RASSLs är baserade på GPCR, modifierade jonkanaler som heter farmakologiskt selektiva Ställdonsmoduler (Psam), har också använts för att modulera neurons aktivitet. Psam: er är baserade på studier som indikerar att det är möjligt att transplantera den extracellulära ligandbindningsdomänen för den nikotiniska ach-receptorn (nachr) på jonpordomänen för andra ligandgrindade jonkanaler. När den nachr-ligandbindningsdomänen 7 splitsas med jonpordomänen för 5-HT3-receptorn, produceras en jonkanal med 6-HT3 nachr-farmakologi men med 5-HT3 katjonledningsegenskaper (Eiselubbi et al., 1993).

på samma sätt ger skarvning av den nachr-ligandbindningsdomänen i 7 med jonpordomänen för den kloridselektiva glycinreceptorn (GlyR) en ACH-responsiv kloridkanal (Grutter et al., 2005). Selektiv mutation av nachr-ligandbindningsdomänen 7 genererar följaktligen PSAM-jonkanaler, som inte visar någon ach-bindning, men är fortfarande selektivt bundna av föreningar som kallas farmakologiskt selektiva Effektormolekyler (psem).

Psam eller chimära jonkanaler som möjliggör reglering av anjon-eller katjonkonduktans har producerats genom kombinationen av den muterade nachr-ligandbindningsdomänen (med två eller en mutationer) med jonpordomänen för flera olika ligand-gated jonkanaler. Sådana psam-chimärer namnges baserat på deras mutationer såväl som länkad jonpordomän — PSAML141F,Y115F-GlyR, PSAML141F-GlyR, PSAML141F,Y115F-GABAC och PSAML141F, Y115F-5-HT3. Aktivering av neuronal aktivitet aktiveras av 5-HT3-innehållande chimärer, medan GABAC-och GlyR-innehållande chimärer är hämmande (se Figur 2) (Magnus et al., 2011; Sternson & Roth, 2014).

Figur 2. Verkningsmekanism för PSEMs. Aktiverande Psam: er består av en muterad nachr-ligandbindningsdomän som är muterad med jonpordomänen för en katjon-selektiv kanal, såsom 5-HT3. Bindning av psem till aktiverande Psam resulterar i en tillströmning av katjoner och aktivering av neuronal aktivitet. Hämmande Psam: er består av en muterad 20 nAChR-ligandbindningsdomän skarvad med jonpordomänen hos en anjonselektiv kanal, såsom GlyR. Bindning av PSEMs till hämmande PSAMs resulterar i en tillströmning av anjoner och hämning av neuronal aktivitet. Bildkredit: Tocris Bioscience

vetenskapliga recensioner för vidare läsning

• Campbell & Marchant (2018) användningen av kemogenetik i beteende neurovetenskap: receptorvarianter, inriktningsmetoder och varningar. Br J Pharmacol. 175, 994.
• Roth (2016) DREADDs för Neurovetenskapsmän. Nervcell. 89, 683.
• Magnus et al. (2011) kemisk och genteknik av selektiva ligand-jonkanalinteraktioner. Vetenskap. 333, 1292.
• Sternson & Roth (2014) Kemogenetiska verktyg för att förhöra hjärnfunktioner. Annu Rev Neurol. 37, 387.

1. Armbruster et al. (2007) utvecklar låset för att passa nyckeln för att skapa en familj av G-proteinkopplade receptorer som aktiveras kraftigt av en inert ligand. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 5163.
2. Atasoy et al. (2012) dekonstruktion av en neuralkrets för hunger. Natur. 488, 172.
3. Boyden et al. (2005) millisekund-tidsskala, genetiskt riktad optisk kontroll av neural aktivitet. Nat Neurosci. 8, 1263.
4. Bradley & Tobin (2016) Design av nästa generations G-proteinkopplade receptorläkemedel: länka ny farmakologi och in vivo djurmodeller. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 56, 535.
5. Bradley et al. (2018) användningen av kemogenetiska metoder för att studera de fysiologiska rollerna hos muskarinacetylkolinreceptorer i centrala nervsystemet. Neurofarmakologi. 136, 421.
6. Chen et al. (2015) de första struktur-aktivitetsrelationsstudierna för designerreceptorer som uteslutande aktiveras av designerdroger. ACS Chem neurovetenskap. 6, 476.
7. Coward et al. (1998) styrning av signalering med en speciellt utformad Gi-kopplad receptor. Proc Natl Acad Sci USA. 95, 352.
8. Eisel Ukrainian et al. (1993) Chimaerisk nikotin-serotonerg receptor kombinerar ligandbindning och kanalspecifikationer. Natur. 366, 479.
9. Ge et al. (2017) glutamatergiska projektioner från entorhinal cortex till dorsal dentate gyrus medierad kontextinducerad återinförande av heroinsökande. Neuropsykofarmakologi. 42, 1860.
10. Gomez et al. (2017) Kemogenetik avslöjade: DREADD beläggning och aktivering via konverterad clozapin. Vetenskap. 357, 503.
11. Grutter et al. (2005) Molekylär tuning av snabb gating i pentameric ligand-gated jonkanaler. Proc Natl Acad Sci USA. 102, 18207.
12. Jiang et al. (2018) kolinerga neuroner i medial septum upprätthåller ångestliknande beteenden inducerade av kronisk inflammatorisk smärta. Neurosci Lett. 671, 7.
13. Manvich et al. (2018) DREADD-agonisten clozapine N-oxide (CNO) metaboliseras omvänd till klozapin och producerar klozapinliknande interoceptiva stimulanseffekter hos råttor och möss. Sci Rep. 8, 3840.
14. Rapanelli et al. (2017) Histaminmodulering av basala gangliakretsar i utvecklingen av patologisk grooming. Proc Natl Acad Sci USA. 114, 6599.
15. Sasaki et al. (2011) Farmakogenetisk modulering av orexinneuroner förändrar sömn/vakenhet hos möss. PLoS One. 6, e20360.
16. Schwartz et al. (2017) Cortico-accumbens reglering av tillvägagångssätt-undvikande beteende modifieras av erfarenhet och kronisk smärta. Cell Rep. 19, 1522.
17. Thompson et al. (2018) DREADD agonist 21 (C21) är en effektiv agonist för muskarinbaserade DREADDs in vitro och in vivo. ACS Pharmacol Transl Sci. Epub före utskrift.
18. Vardy et al. (2016) en ny DREADD underlättar multiplex kemogenetisk förhör av beteende. Nervcell. 86, 936.
19. Varela et al. (2016) spåra hippocampus tidsberoende roll i minnesåterkallelse med DREADDs. PLoS One. 11, e0154374.
20. Zhang et al. (2007) Multimodal snabb optisk förhör av neurala kretsar. Natur. 446, 633.

om Tocris Bioscience

Tocris Bioscience är din pålitliga leverantör av högpresterande life science-reagenser, inklusive receptoragonister & antagonister, enzymhämmare, jonkanalmodulatorer, fluorescerande prober & färgämnen och sammansatta bibliotek. Vår katalog består av över 4500 forskningsverktyg, som täcker över 400 proteinmål så att du kan undersöka och modulera aktiviteten hos många signalvägar och fysiologiska processer.

vi har arbetat med forskare i över 30 år för att förse life science-samhället med forskningsstandarder samt nya och innovativa forskningsverktyg. Vi förstår behovet av forskare att lita på sina forskningsreagenser, varför vi är engagerade i att förse våra kunder med produkter av högsta kvalitet, så att du kan publicera med förtroende.

Tocris är en del av protein sciences-avdelningen för Bio-Techne, som också inkluderar de bästa i klassvarumärkena R&D Systems, Novus Biologicals, ProteinSimple och Advanced Cell Diagnostics. Bio-Techne har förenat dessa varumärken för att ge forskare en fullständig portfölj av forskningsreagenser, analyser och proteinplattformar. För mer information om Bio-Techne och dess varumärken, besök bio-techne.com.

Policy för sponsrat innehåll: News-Medical.net publicerar artiklar och relaterat innehåll som kan härledas från källor där vi har befintliga kommersiella relationer, förutsatt att sådant innehåll tillför värde till den centrala redaktionella etos News-Medical.Net vilket är att utbilda och informera besökare som är intresserade av medicinsk forskning, vetenskap, medicintekniska produkter och behandlingar.

citat