den klyvda-Caspase-3-antikroppen är en markör för Caspase-9-liknande DRONC-aktivitet i Drosophila

märkning av den klyvda-Caspase-3-antikroppen kvarstår i DCP-1 drICE-dubbla mutanter

för att utvärdera specificiteten hos den klyvda-Caspase-3 antikropp, vi analyserade Eye Imaginal skivor från tredje instar larver. I wild-type Eye imaginal-skivor detekterar antikroppen några döende celler spridda över skivan (Figur 1a). Överraskande, i ögat skivor dubbelt mutant för null allelerna dcp-1prev och drice 21 (ref.14, 15) märker den klyvda-Caspase-3-antikroppen fortfarande celler (Figur 1b). Märkning i DCP-1prev drice bisexuell 1 dubbelmutanter förekommer i kluster (Figur 1b), liknande det som tidigare har observerats när celldöd blockerades av uttrycket av Caspase-3-hämmare P35.3 dessa observationer tyder på att den klyvda-Caspase-3-antikroppen fortfarande detekterar en epitop i frånvaro av Caspase-3-liknande proteiner DCP-1 och DRICE. Ändå, eftersom apoptos i detta skede inte förekommer i ett definierat mönster, var vi osäkra på specificiteten hos dessa märkningssignaler.

därför använde vi GMR-hid-transgener,en väl karakteriserad apoptotisk Modell, 5 för att ytterligare undersöka specificiteten hos den klyvda-Caspase-3-antikroppen. Genom GMR-driven uttryck av den pro-apoptotiska genen hid specifikt i den bakre halvan av det utvecklande ögat inducerar GMR-hid-transgener apoptos i två distinkta vågor som visas av klyvad-Caspase-3-antikropp och TUNEL-märkning28 (figur 1C, d). För att utvärdera specificiteten hos den klyvda-Caspase – 3-antikroppen undersökte vi GMR-hid-ögonskivor som var dubbelt mutanta för dcp-1prev och drice xhamster 1. I överensstämmelse med förväntningen upphäver förlusten av DCP-1prev och drice 21 fullständigt TUNEL-positiv apoptos i GMR-hid-skivor (figur 1F). Överraskande visade dock DCP-1prev drice bisexuell 1 dubbelmutant GMR-hid ögonskivor fortfarande stark immunreaktivitet med klyvad-Caspase-3-antikropp (figur 1e). Således upptäcker den klyvda-Caspase – 3-antikroppen inte eller inte bara DRICE och / eller DCP-1. Vi noterar dock att märkningsutseendet hos den klyvda-Caspase – 3-antikroppen förändras i frånvaro av DCP-1 och DRICE (jämför figur 1c och e). Märkningssignalen är inte längre begränsad till två distinkta vågor (figur 1C), utan fyller snarare hela det bakre facket på ögonskivan och är begränsat till interommatidiala celler (figur 1e). En liknande förändring av märkningsmönster har rapporterats för CM1-antikroppsmärkning vid uttryck av kaspashämmaren P35.3 Denna förändring av märkningsmönstret är sannolikt på grund av det faktum att celler i DCP-1prev drice bisexuell 1 dubbelmutant GMR-hid ögonskivor inte dör (figur 1F) och därmed upprätthåller epitopen detekterad av klyvad-Caspase-3-antikropp. Det är emellertid viktigt att notera att denna analys visar detektering av en epitop i frånvaro av Caspase-3-liknande proteiner DCP-1 och DRICE genom klyvad-Caspase-3-antikropp.

immunoreaktivitet hos den klyvda-Caspase-3-antikroppen beror på apoptosomkomponenterna DRONC och ARK

det finns två möjligheter varför den klyvda-Caspase-3-antikroppen märker dcp-1 drICE dubbla mutanta celler, även om de inte är apoptotiska. För det första kan antikroppen inte detektera en apoptotisk epitop; eller för det andra kan antikroppen detektera en apoptotisk epitop genererad uppströms eller parallellt med DCP-1 och DRICE. För att skilja mellan dessa möjligheter undersökte vi GMR-hid eye discs mutant för apoptosomkomponenterna DRONC och ARK, som verkar uppströms DRICE och DCP-1. I dronc och ark mutant GMR-hid eye-skivor blockeras både TUNEL och cleaved-Caspase-3 antikroppsmärkningar (Figur 1 g,h; figur 3a,b). Dessa data bekräftar att den klyvda-Caspase-3-antikroppen verkligen detekterar en apoptotisk epitop i Drosophila. Eftersom det misslyckas med att upptäcka den apoptotiska epitopen i dronc-och ark-mutanter, men inte i DCP-1 drICE-dubbla mutanter, är det mer exakt att betrakta den klyvda-Caspase-3-antikroppen som en markör för DRONC-aktivitet, snarare än effektor-caspasaktivitet, i döende Drosophila-celler.

tripeptiden ETD är den apoptotiska epitopen som detekteras av klyvad-Caspase-3-antikropp

epitopen som detekteras av den klyvda-Caspase-3-antikroppen beror på DRONC-aktivitet. Det kan vara möjligt att antikroppen direkt känner igen aktiverad DRONC. Alternativt är det också möjligt att den klyvda-Caspase-3-antikroppen detekterar en epitop genererad genom klyvning av ett okänt substrat av aktiv DRONC, oberoende av DRICE och DCP-1.

för att skilja mellan dessa två möjligheter anpassade vi resterna från den katalytiska cysteinen (Cys163) till klyvningsstället vid Asp175 av humant Caspase-3 (Caspase-3-peptid) med motsvarande regioner i Drosophila-kaspaserna (figur 2a; se även ref. 3). De mest C-terminala resterna av Caspase – 3-peptiden, ETD, bevaras i DRICE och DCP-1 (figur 2a). I likhet med Caspase-3 är detta klyvningsstället för aktivering av åtminstone DRICE,29 och eventuellt DCP-1. Det är intressant att notera att N-terminalen, två tredjedel av Caspase-3-peptiden, har högsta likhet med DRONC; sex av nio rester bevaras (figur 2a). Denna del av Caspase – 3-peptiden är mindre välbevarad i DRICE, DCP-1 och de återstående Drosophila-kaspaserna. Även om klyvning mellan de stora och små subenheterna av DRONC inte är nödvändig för dess aktivitet,30, 31 och kanske inte förekommer in vivo, övervägde vi möjligheten att antikroppar riktade mot den N-terminala delen av Caspase-3-peptiden direkt kan detektera aktiv DRONC i döende celler.

vi använde blockerande peptider för att utvärdera vilka epitoper av Caspase-3-peptiden detekteras av den klyvda-Caspase-3-antikroppen i döende Drosophila-celler. Sekvenserna av de blockerande peptiderna visas i Figur 2B och understryks i Figur 2a. Blockerande peptid A (TETD) härrör från DRICE och DCP-1 och blockerande peptid B (CRGDEYDLG) motsvarar regionen med högsta likhet i DRONC (figur 2a,b). Peptid C är en kontrollpeptid som motsvarar resterna omedelbart intill peptid B i DRONC (figur 2a,b). Peptid D är en annan kontrollpeptid, som är mycket lik peptid A och härrör från PRODOMÄNEN för DRONC vid position 113. Om PRODOMÄNEN för DRONC klyvs på denna plats kommer den att exponera ESD vid dess C-terminal, vilket är mycket lik C-terminalen för Caspase-3-peptiden (ETD, peptid A) och kan således detekteras av den klyvda-Caspase-3-antikroppen.

de blockerande peptiderna blandades med den klyvda-Caspase-3-antikroppen 60 min före inkubation med Eye imaginal-skivorna. Resultaten av blockeringsexperimenten sammanfattas i Figur 2B och för peptiderna A och B visas i Figur 2C–f. Peptid A är tillräcklig för att blockera hela immunoreaktiviteten hos den klyvda-Caspase-3-antikroppen i GMR-hid och i DCP-1 drICE double mutant GMR-hid eye-skivor (figur 2C,d). Däremot upphäver peptid B inte immunreaktiviteten hos antikroppen i dessa skivor (figur 2e,f). Kontrollpeptiderna C och D misslyckas också med att blockera klyvad-Caspase-3-immunreaktivitet (Figur 2B; data visas inte).

dessa data visar att den klyvda-Caspase-3-antikroppen specifikt detekterar epitopen ETD i apoptotiska celler. Bland Drosophila-kaspaserna är denna epitop endast närvarande i DRICE och DCP-1, vilket gör det mycket troligt att antikroppen verkligen upptäcker dessa effektorkaspaser. Däremot tyder det faktum att de DRONC-härledda peptiderna B, C och D inte blockerar immunreaktivitet på att det är osannolikt att antikroppen direkt detekterar aktiv DRONC. Därför, eftersom den klyvda-Caspase-3-antikroppen inte förlorar immunoreaktivitet i DCP-1 drICE-dubbla mutanter (figur 1e), detekterar den åtminstone ett annat protein, vilket exponerar ETD-epitopen på ett DRONC-beroende sätt.

aktivering av DCP-1 oberoende av ARK återställer klyvad-Caspase-3-immunoreaktivitet

analysen som presenteras i Figur 2 antyder, men bevisar inte, att den klyvda-Caspase-3-antikroppen verkligen upptäcker klyvad DCP-1 och DRICE. För att direkt testa denna möjlighet, vi uttryckte en GMR-OC-DCP-1 transgen i ark mutant bakgrund. Usci-DCP-1 saknar den N-terminala prodomänen för DCP-1. Man tror att PRODOMÄNUTARMAD ACC-DCP-1 lätt främjar autoprocessing, och konsekvent uttryck under GMR-kontroll inducerar en ögonablationsfenotyp.32 denna ögonablationsfenotyp orsakas av induktion av apoptos (figur 3c,d). Som nämnts ovan misslyckas ark-mutanta kloner i GMR-hid-bakgrunden att inducera TUNEL-positiv apoptos (figur 3b) och den klyvda-Caspase-3-antikroppen har ingen immunreaktivitet i ark-kloner (figur 3a) vilket tyder på att varken DCP-1 eller DRICE eller de okända DRONC-substraten klyvs i ark-mutanta kloner. Därför testade vi om uttryck av USC-DCP-1 i frånvaro av apoptosomaktivitet, det vill säga i arkkloner, kan återställa klyvad-Caspase-3-antikroppsmärkning. Jämfört med vildtypsvävnad (markerad med GFP i Figur 3C,c’) reduceras antalet klyvda-Caspase-3-positiva celler kraftigt i arkmutanta kloner (figur 3C, c’) vilket tyder på att aktivering av ACCHIBN-DCP-1 är åtminstone delvis beroende av apoptosomen. Emellertid innehåller cirka 50% av arkmutanta kloner (n=32) i GMR-OC-DCP-1-bakgrunden klyvda-Caspase-3 immunoreaktiva celler (pilar i Figur 3C, c’). Detta är osannolikt att vara en märkning artefakt, eftersom dessa celler är också TUNEL-positiva (figur 3d, d’). Därför, eftersom DRONC är inaktiv i ark-mutantbakgrund som tyder på att den klyvda-Caspase-3-märkningssignalen inte orsakas av det okända DRONC-substratet, visar denna analys att den klyvda-Caspase-3-antikroppen verkligen upptäcker klyvad DCP-1. Det är också möjligt att den klyvda-Caspase-3-antikroppen detekterar klyvad DRICE i detta experiment, eftersom DCP-1 kan proteolytiskt bearbeta DRICE, åtminstone in vitro.29, 32 en liknande analys med DRICE kunde inte utföras eftersom GMR-drICE och GMR-Baccarat-drICE inte orsakar en ögonablationsfenotyp.32 icke desto mindre, om DCP-1 klyver DRICE in vivo eller inte, med tanke på sekvenslikheten hos DCP-1 och DRICE vid C-änden av den stora subenheten och peptidblockeringsdata i Figur 2, antyder det att antikroppen också kan detektera klyvad DRICE.