den industriella anaeroben Clostridium acetobutylicum använder polyketider för att reglera cellulär differentiering

bakteriestammar och media

C. acetobutylicum ATCC 824 odlades i en anaerob kammare (Coy laboratorieprodukter) innehållande en atmosfär av 97% kväve och 3% väte. 2xytg medium67 innehöll 16 g/l trypton, 10 g/l jästextrakt, 5 g/l NaCl och 10 g/L glukos (om inte annat anges) med pH justerat till 5.2 för flytande media och 5,8 för fasta medier (även innehållande 15 g/L agar). Clostridial growth medium (CGM)68 innehöll 30 g/L glukos (om inte annat anges), 6,25 g/l jästextrakt, 2,5 g/l ammoniumsulfat, 1,25 g/L NaCl, 2,5 g/l asparagin, 0,95 g/l monobasiskt kaliumfosfat, 0,95 g/l dibasiskt kaliumfosfat, 0,5 g/l magnesiumsulfatheptahydrat, 13 mg/l mangansulfatheptahydrat och 13 mg/l järnsulfat heptahydrat med pH justerat till 6,4. P2 medium69 innehöll 80 g/L glukos (om inte annat anges), 1 g/l jästextrakt, 2,2 g/l ammoniumacetat, 0.5 g/L kaliumfosfatmonobasiskt, 0,5 g/l kaliumsulfat dibasiskt, 0,2 g/l magnesiumsulfatheptahydrat, 1 mg/l para-aminobensoesyra, 1 mg/l tiaminhydroklorid, 10 kg/l biotin, 10 mg/l mangansulfatheptahydrat, 10 mg/l järnsulfat heptahydrat och 10 mg/l NaCl med pH justerat till 6,4. Clostridial basal medium (CBM) 70 innehöll 10 g/L glukos, 0,5 g/l monobasiskt kaliumfosfat, 0,5 g/l dibasiskt kaliumfosfat, 4 g/l trypton, 0.2 g/L magnesiumsulfatheptahydrat, 10 mg/l mangansulfatheptahydrat, 10 mg/l järnsulfatheptahydrat, 1 mg/l para-aminobensoesyra, 1 mg/l tiaminhydroklorid och 2 kg/l biotin med pH justerat till 6,9. För fasta CGM-plattor tillsattes 15 g/L agar. CBM-S (används för flytande sporulationsanalyser) var identisk med CBM förutom att 50 g/L glukos användes och 5 g/l CaCO3 tillsattes strax före ympning av kulturer. E. coli TOP10 (Thermo Fischer Scientific) odlades i Luria-Bertani (LB) – medium vid 37 kcal C. För lämpliga Clostridium-stammar kompletterades odlingsmedier med erytromycin (Ery; 40 kg/mL för fasta medier, 80 kg/mL för flytande medier) och/eller tiamfenikol (Th; 5 kg/mL för fasta och flytande medier). Kanamycin (kan; 60 occurg/mL) eller kloramfenikol (Cm; 25 occurg/mL) tillsattes till E. coli odlingsmedier såsom anges. Clostridium-och E. coli-stammar bibehölls som 20% v/V glycerolbestånd lagrade vid -80 C.

Plasmidkonstruktion

oligonukleotider tillhandahölls genom integrerad DNA-teknik (kompletterande Tabell 5). Phusion polymeras (NEB) användes för alla PCR-reaktioner. För isolering av genomiskt DNA från C. acetobutylicum ATCC 824 användes en alkalisk lysmetod 71. C. acetobutylicum odlades över natten i 2xytg medium till stationär fas (OD600 > 2.0), vid vilken tidpunkt 10 mL kultur centrifugerades vid 3500 kcal g för 15 min (rumstemperatur). Supernatanten kasserades och cellpelleten återsuspenderades i 5 mL SETBUFFERT (75 mM NaCl, 25 mM EDTA pH 8.0, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5). Lysozym tillsattes till en slutlig koncentration av 2 mg/mL och lösningen blandades försiktigt. Blandningen inkuberades vid 37 C i 60 minuter med mild blandning utförd var 15: e minut. Efter inkubationsperioden tillsattes 660 occyl lysbuffert (1 m NaOH, 10% w/v SDS) och lösningen blandades noggrant. Proteinas K sattes till en slutlig koncentration av 0,5 mg / mL, och lösningen inkuberades vid 55 C i 1 h. efter denna inkubationsperiod tillsattes en lika stor volym fenol:kloroform (1:1) och lösningen blandades genom inversion i 5 min. Lösningen centrifugerades sedan vid 3500 kcal g under 15 min (rumstemperatur) och den övre vattenfasen kastades bort genom pipettering. Till den organiska fasen tillsattes 3 m natriumacetat (10% v/v i slutlig lösning). För att fälla ut genomiskt DNA tillsattes 2 volymer etanol och lösningen blandades. Utfällt genomiskt DNA uppsamlades med användning av en glaskrok och tvättades med 70% etanol. Det tvättade DNA torkades sedan över kvävgas i 15 minuter, resuspenderades i låg te-buffert (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) och löstes genom inkubation vid 50 kcal C.

för att konstruera plasmid pKO_mazF_mod (som senare skulle fungera som en mall för pKO_pks) användes primers pKON_Fo och pKON_Ro för att PCR amplifiera en 5.0 kb-region från pko_mazf-mallen15. Detta steg var nödvändigt för att ta bort en 677 bp-region från pko_mazf-ryggraden, som vi inte kunde förstärka via PCR. 5.0 kb PCR-produkten renades gel, digererades vid 5′ och 3 ’ – ändarna med användning av PshAI, ligerades för att bilda pKO_mazF_mod och transformerades till E. coli TOP10. Transformantkloner screenades genom renad plasmidtest digestion, och Sanger-sekvensering användes för att bekräfta sekvensen för den slutliga pko_mazf_mod-klonen. För att konstruera plasmid pKO_pks (för radering av pks-genen från C. acetobutylicum), en 3,8 kb-region innehållande colE1, repL, bgaR och mazF förstärktes PCR från pKO_mazF_mod med användning av primers pKO_F och pKO_R. dessutom användes primers UHR_Fo och UHR_Ro, och DHR_Fo och DHR_Ro för att PCR amplifiera 1 kb-regioner som representerar de uppströms och nedströms homologa regionerna (UHR och dhr_ro DHR) flankerar PKS-genen (ca_c3355) från en C. acetobutylicum ATCC 824 genomisk DNA-mall. Kloramfenikol / tiamfenikolresistensgenen och konstitutiv promotor (P ptb från C. acetobutylicum) förstärktes PCR från pKO_mazF_mod med användning av primers CMR_F och CMR_R (1,1 kb-region). Dessa fyra PCR-produkter ligerades via Gibson-montering och omvandlades till E. coli TOP10. Transformantkloner screenades genom renad plasmidtest digestion, och Sanger-sekvensering användes för att bekräfta sekvensen för den slutliga pko_pks-klonen. För konstruktion av plasmid pAN315 (nödvändigt för metylering av pKO_pks och pCKO_pks före omvandling till C. acetobutylicum), en 6,4 kb-region från plasmid pAN172 förstärktes med användning av primers pAN1_F och pAN1_R, och en 1,0 kb-region innehållande kanamycinresistensgenen från vektor pCOLA_Duet förstärktes med användning av primers KAN_Fo och kan_ro. De gel extraherade PCR-produkterna ligerades via Gibson-montering och transformerades till E. coli TOP10. Transformerande kloner screenades genom renad plasmidtest digestion, och Sanger-sekvensering användes för att bekräfta sekvensen för den slutliga pAN3-klonen. För att konstruera plasmid pCKO_pks (för uttryck av PKS-genen under den konstitutiva crotonaspromotorn från C. acetobutylicum), primers CPKS_Fo och CPKS_Ro användes för att PCR förstärka 5.4 kb C. acetobutylicum ATCC 824 pks-genen (CA_C3355) med lämpliga överhäng för Gibson-montering. Pwis_empty vector71-ryggraden (innehållande den konstitutiva crt-promotorn uppströms om multipelkloningsstället) förstärktes PCR med användning av primers pWIS_F och pWIS_R vilket gav en 5.0 kb-produkt. De två gelrenade PCR-produkterna ligerades via Gibson-montering och transformerades till E. coli TOP10. Transformerande kloner screenades genom renad plasmidtest digestion, och Sanger-sekvensering användes för att bekräfta sekvensen för den slutliga pcko_pks-klonen.

för att konstruera plasmid pET24b_pks förstärktes 5.4 kb C. acetobutylicum ATCC 824 pks-genen (CA_C3355) från C. acetobutylicum genomiskt DNA med användning av primers PKS_Fo och PKS_Ro. Dubbelt digererad vektor pET24b (EcoRI/XhoI digererad) ligerades med dubbelt digererad pks PCR-produkt (EcoRI/XhoI digererad) och ligeringsprodukten transformerades till E. coli TOP10. Transformantkloner screenades genom renad plasmidtest digestion, och Sanger-sekvensering användes för att bekräfta sekvensen för den slutliga pET24b_pks-klonen.

Elektrotransformation av C. acetobutylicum

före transformation till C. acetobutylicum transformerades vektor pKO_pks med pAN3 till E. coli TOP10 via elektroporation. Denna procedur möjliggjorde metylering av pKO_pks som var nödvändig för att övervinna det ursprungliga restriktionsmodifieringssystemet som är aktivt i C. acetobutylicum 72. Plasmidrening av E. coli pko_pks / pAN3 vätskekultur utfördes och den resulterande plasmidblandningen användes för elektroporationer av C. acetobutylicum med användning av den tidigare publicerade metoden72 som vi beskriver här. För att förbereda elektrokompetenta celler var en enda koloni av C. acetobutylicum från en 2xytg-platta (mer än 1 vecka gammal) värmechockad vid 80 kcal C i 10 min och brukade inokulera 10 mL CGM. Efter att ha inkuberats över natten vid 37 msk C och nått mitten av exponentiell fas (OD600 0,4–0,9) användes 6 mL kultur för att inokulera 54 mL färsk 2xytg. Denna subkultur inkuberades vid 37 2CB tills den nådde OD600 1.2 (~5 h), vid vilken tidpunkt subkulturen centrifugerades vid 3500 kg i 20 minuter (4 kg C). Efter avlägsnande av supernatanten återsuspenderades cellpelleten i 20 mL iskall elektroporationsbuffert (EPB; 270 mM sackaros, 5 mM NaH2PO4, pH 7.4). De resuspenderade cellerna centrifugerades vid 3500 kg i 10 minuter (4 C i C), supernatanten kastades bort och cellpelleten resuspenderades i 20 mL iskall EPB. Efter en slutlig pelletering genom centrifugering vid 3500 kg i 10 min (4 C i C) kastades supernatanten och pelleten återsuspenderades i 2,3 mL iskall EPB. Denna slutliga resuspension användes som lager av elektrokompetenta celler. Elektrotransformationer utfördes genom att först blanda (över is) 500 occl kompetenta celler och ~20 occl av plasmid-DNA-lösning (1-5 occlg totalt) för att transformeras. Blandningen överfördes till en 0,4 cm elektroporationskuvett och fick inkubera på IS i 15 minuter. Elektroporationer utfördes med följande parametrar: spänning, 2000 V; kapacitans, 25 occupf; motstånd, oändlig Occup. Efter elektroporation återsuspenderades proverna i 1 mL 2xytg och överfördes till ett rör innehållande 9 mL 2xytg. Efter blandning genom inversion tilläts kulturerna att återhämta sig vid 37 kg C under 4 timmar. återvinningskulturerna centrifugerades vid 3500 kg i 15 minuter (rumstemperatur) och supernatanten kastades bort. Cellpelleten återsuspenderades i 500 2xytg-2xytg-200 – 2xytg-plattor pläterades på fasta 2xytg-plattor kompletterade med lämpligt antibiotikum. Plattan inkuberades vid 37 C i 2-3 dagar, och transformerande kolonier utsattes för PCR – baserad verifiering.

Deletion av PKS-genen och genetisk komplettering

riktad KO av PKS-genen (ca_c3355) i C. acetobutylicum ATCC 824 uppnåddes med användning av den tidigare publicerade metoden15. I detalj omvandlades 5 occyg metylerad pko_pks/pAN3 plasmidblandning till C. acetobutylicum med användning av den ovan beskrivna metoden. Efter återvinning i flytande 2xytg medium för 4 h, var cellpellets uppsamlades genom centrifugering (3500 kg, 15 min, rumstemperatur), resuspenderade i 0,5 mL färsk vätska 2xytg, och 100 kg av den resuspenderade cellkulturen pläterades på fast 2xytg + 5 kg/mL TH + 40 mM, 2xytg-laktosplattor. Under dessa pläteringsförhållanden förväntas endast celler som har genomgått den önskade homologa rekombinationshändelsen med dubbel crossover överleva. Motval av vektorryggraden tillhandahålls av den laktosinducerbara promotorn (P bgaL ), som driver toxingenen mazF på pko_pks-vektorryggraden. Efter denna pläteringsprocedur observerades ungefär 10 kolonier på 2xytg + 5 oc/mL TH + 40 mM oc-laktosplattor. Av dessa 10 kolonier var fyra två gånger restreaked och utsattes för koloni PCR-verifiering. Fyra uppsättningar av primers användes som grund för koloni PCR verifiering, såsom beskrivs i kompletterande Fig. 2.

för att generera PKS-genetisk komplementeringsstam utfördes elektroporering av PKS C. acetobutylicum med en pcko_pks/pAN3-plasmidblandning som beskrivits ovan. Efter elektroporering och återhämtning pläterades kulturer på fast 2xytg + 5 occurg/mL TH + 40 occurg/mL Ery media. Efter två gånger restreaking på fast 2xytg + 5 USC/mL TH + 40 USC/mL Ery media, potentiella kolonier hyser pCKO_pks screenades via koloni PCR med användning av primers pCKO_F och pCKO_R.

LC-HRMS-metabolomisk analys

för oriktade metabolomiska jämförelser av vildtyp och pankreas pks C. acetobutylicum, enstaka kolonier av varje stam var värmechockade vid 80 kcal C för 10 min och användes för att inokulera 10 mL flytande CGM (30 g/L glukos). Efter inkubation över natten (stillastående) tills de nådde OD600 ~1,0 användes dessa kulturer för att inokulera 10 mL flytande CGM (80 g/L glukos) med ett 10% inokulum för subkultur. Efter ~5 h (OD600 ~1.0) av stagnerande tillväxt användes subkulturerna för att inokulera fyrdubbla kolvfermentationer (70 mL CGM, 80 g/L glukos + 5 occyl Antifoam 204, 3% inokulum) agiterade via magnetiska omrörningsstänger. Kalciumkarbonat (6 g/L) kompletterades till fermenteringsmediet för pH-buffring. All odling utfördes vid 37 2CG C. Cirka 5 CCG / mL TH inkluderades i alla kulturer av PKK i PK med undantag för den slutliga jäsningskulturen, eftersom vissa antibiotika är kända för att störa Abe-jäsningsfaserna. Prover av fermenteringsbuljong (1 mL) från varje replikat togs under tidig stationär fas och extraherades med 3 mL 2:1 kloroformmetanol. Blandningarna vortexerades, separerades via centrifugering (2700 kcal g, 10 min) och det nedre kloroformrika skiktet överfördes till en glasflaska. Dessa organiska extrakt torkades med kvävgas, resuspenderades i 100 oc metanol och 10 oc injicerades på ett Agilent Technologies 6520 exakt massa QTOF LC-MS-instrument utrustat med en Agilent Eclipse Plus C18-kolonn (4,6 oc 100 mm). En linjär gradient av 2-98% CH3CN (vol/vol) över 40 min i H2O med 0,1% myrsyra (vol/vol) vid en flödeshastighet av 0,5 mL/min användes. Den metabolomiska analysplattformen XCMS16 (Scripps Research Institute) användes för att jämföra metabolomerna av vildtyp och PKS-stammar av PKS baserat på fyrdubbla LC-HRMS-data. MS-toppar som är unika för PKS i form av PKS (Fig. 1A) identifierades med hjälp av följande parametrar: p-värde < 0,01, vikbyte > 10,0, toppintensitet > 5000.

bioreaktorfermentationer

för att jämföra Abe-fermentationsprofiler av vildtyp och bisexuell pks C. acetobutylicum, bioreaktorfermentationer utfördes i DASGIP-bioreaktorer (4 msk GPI 100 fartyg, Dasgip Bioblock-System) med 500 mL arbetsvolymer. Nattkulturer (10 mL CGM, 30 g/L glukos, stillastående, 34 CCB) inokulerade med värmechockade enskilda kolonier av C. acetobutylicum odlades tills de nådde OD600 ~1. Ett 10% inokulum användes sedan för att starta en subkultur (30 mL P2-media, 80 g/L glukos, stillastående, 34 kcal C) och subkulturen inkuberades tills den nådde OD600 ~1. Subkulturerna på 30 mL överfördes sedan aseptiskt till enskilda Dasgip-bioreaktorer förinstallerade med 500 mL P2-medium (80 g/L glukos, 100 occyl Antifoam 204, 34 Occyl C). Fermentationerna tilläts fortsätta i 54 h med periodisk provtagning för optiska densitetsmätningar, fermentationsproduktanalys och kvantifiering av föreningar 1, 2 och 3. Temperaturen bibehölls vid 34 C i hela jäsningen, omrörningen tillhandahölls genom omröring vid 200 rpm och pH-värdet bibehölls över 5,0 via automatisk tillsats av 3 M NH4OH. För att upprätthålla anaeroba förhållanden sparades syrefri kvävgas med en hastighet av 2 sL/h under jäsningens varaktighet. För kvantifiering av föreningarna 1, 2, och 3, 1 mL av fermentation buljong blandades med 3 mL etylacetat, vortexed, separeras via centrifugering (2700 kcal g, 10 min, rumstemperatur), och det övre organiska skiktet isoleras. Det organiska skiktet torkades genom roterande indunstning, resuspenderades i 200 oc metanol och 20 oC injicerades på ett Agilent Technologies 6120 Quadrupole LC-MS (med DAD) instrument utrustat med en Agilent Eclipse Plus C18-kolonn (4,6 oc 100 mm). En linjär gradient av 2-98% CH3CN (vol/vol) över 40 min i H2O med 0,1% myrsyra (vol/vol) vid en flödeshastighet av 0,5 mL/min användes. Föreningar 1, 2 och 3 identifierades genom UV-absorption (240 nm) såsom visas i Fig. 1b och kvantifierades av det integrerade toppområdet (absorbans vid 240 nm).

Jäsningsanalytiska procedurer

en spektrofotometer användes för att bestämma celldensiteter genom att mäta den optiska densiteten vid 600 nm (OD600). Ett Shimadzu Prominence UFLC-system utrustat med en biorad Aminex HPX-87H-kolonn (300 mm 7,8 mm) användes för att analysera C. acetobutylicum fermentationsbuljong för koncentration av glukos och fermentationsprodukter (acetat, butyrat, laktat, aceton, butanol och etanol). Prover av fermentationsbuljong (1 mL) pelleterades först genom centrifugering vid 10 000 kg i 3 minuter, följt av filtrering av supernatanten med användning av ett 0,22 mikron PVDF-sprutfilter. Prover av filtrerad supernatant (20 oC) injicerades på UFLC-systemet med 0,01 n svavelsyra mobil fas som strömmar vid 0,7 mL / min, kolonntemperatur på 35 oc C och kromatograferades i 35 min. Analyter detekterades genom användning av en brytningsindexdetektor (används för att kvantifiera koncentrationer av glukos, acetat, laktat, butanol och etanol) och en diodmatrisdetektor (används för att kvantifiera koncentrationer av butyrat (208 nm) och aceton (265 nm)).

RNA-isolering och RNA-Seq-analys

prover (10 mL) fermentationsbuljong togs i biologiskt triplikat från bioreaktorfermentationer av vildtyp och 26 timmar efter inokulering. Proverna centrifugerades (4000 CG, 10 min, 4 CG) och pelletsen resuspenderades och lagrades i Rnaprotect Cellreagens (Qiagen). Totalt RNA extraherades med användning av ett Rneasy Mini Kit (Qiagen) enligt tillverkarens instruktioner. En dnasbehandling på kolonnen utfördes med användning av DNase i (RNase-free) (NEB). RNA kvalitetskontroll, bibliotekskonstruktion och bibliotekssekvensering utfördes av University of California-Berkeley QB3 Functional Genomics Laboratory och Vincent J. Coates genomic Sequencing Laboratory. RNA-kvalitet och koncentration bedömdes med användning av en nanochip på en Agilent 2100 Bioanalysator. Bakteriell 16S och 23s rRNA avlägsnades med användning av en RiboZero Kit (Illumina). Det resulterande budbärar-RNA (mRNA) omvandlades till ett RNA-Seq-bibliotek med hjälp av ett mRNA-SEQ-bibliotekskonstruktionssats (Illumina). RNA-bibliotekssekvensering utfördes på en Illumina HiSeq4000 med 50 bp enda ände läser. Sekvenseringsläsningar (50 bp ) bearbetades och mappades till C. acetobutylicum ATCC 824-genomet (NCBI-anslutning NC_003030.1 och NC_001988.2) med CLC Genomics Workbench 9.0 med standardparametrar. Läser som inte unikt anpassade sig till genomet kasserades. Skillnader i genuttryck mellan wild-type och acetobutylicum beräknades med användning av samma programvara. Gener ansågs differentiellt uttryckta med p-värde < 0,003 (baserat på ett oparat t-test, n = 3) och |normaliserad vikförändring |> 2,0. Felaktiga upptäcktshastighetskorrigeringar till p-värden beräknades i CLC Genomics Workbench 9.0 med användning av en publicerad metod73. Resultaten av RNA-Seq-analysen presenteras i kompletterande Data 1. STRÄNGANALYS30 utfördes för att bestämma förmodade protein-proteininteraktioner mellan de differentiellt uttryckta generna som avslöjades genom RNA-Seq-analys.

fenotyp jämförelse analyser

flytande sporulation analyser utfördes med mindre modifieringar74. Prover togs från biologiska triplikatvätskekulturer efter 5 dagars inkubation (30 mL CBM-S, 37 kcal C). De 20 oktylproverna var värmechockade (80 oktyl C, 10 min), utspädningar (101-106) sågs på 2xytg-plattor och kolonier räknades upp efter 30 h inkubation (37 oktyl C) för att beräkna antalet värmebeständiga kolonibildande enheter (cfu/mL). För kemisk komplementering av PKS i den flytande sporulationsanalysen kompletterades renad clostrienos (slutlig koncentration 3,5 kg) i cbm-s-kulturer av PKS C. acetobutylicum vid tidpunkten för ympningen. Eftersom förening 3 tillsattes som en koncentrerad lösning i metanol, tillsattes den ekvivalenta volymen metanol (60 baccoll) till alla andra vätskeformiga sporuleringsanalyskulturer (vildtyp och icke-kompletterad PKS för att kontrollera denna effekt.

för fasta sporulationsanalyser användes en tidigare beskriven metod75 med vissa modifieringar. I detalj odlades värmechockade (80 kg C, 10 min) enskilda kolonier i flytande media (10 mL kg, 37 kg C) i 24 timmar. kulturer späddes med en faktor 106 och pläterades på fast CBM. Provtagning utfördes 1, 2, 3, 4 och 6 dagar efter initial plätering. För provtagning kombinerades tre enskilda kolonier och resuspenderades grundligt i 60 occyl flytande CGM. 20 oktyl av den resuspenderade koloniblandningen värmechockades sedan (80 oktyl C, 10 min), utspädningar (101-106) sågs på 2xytg-plattor och kolonier räknades upp efter 30 h inkubation (37 oktyl C) för att beräkna antalet värmebeständiga kolonibildande enheter (cfu/koloni). Alla prover utfördes som biologiska triplikat.

Granulosaackumuleringsanalyser utfördes via jodfärgning53. Mid-log fas (OD600 ~0.6) vätskekulturer (P2, 37 CB) pläterades på fast 2xytg medium med förhöjda glukosnivåer (50 g/L) för att möjliggöra granulosproduktion. Plattorna inkuberades vid 30 kcal C i 4 dagar, vid vilken tidpunkt de färgades genom exponering för en bädd av jodkristaller i 10 minuter. Plattorna fick sedan destain för 10 min före avbildning. För kemisk komplementering av PKS i granulosaackumuleringsanalysen, renad clostrienos (slutlig plattkoncentration 4,0 oz. m) inbäddades i fasta 2xytg-plattor före plätering av PKS-kulturen i PKS. Eftersom clostrienos tillsattes till 2xytg-plattor som en koncentrerad lösning i metanol (blandad i det smälta mediet före stelning), tillsattes den ekvivalenta volymen metanol (6 ggr) till alla andra 2xytg-plattor som användes i granulosaackumuleringsanalyserna för att kontrollera för denna effekt.

enskilda kolonier av C. acetobutylicum odlade på CBM-plattor för 48 h (37 CB) sågs och avbildades med hjälp av ett Leica mz16 F-dissekeringsmikroskop utrustat med en Leica DFC300 FX-kamera.

oljespridningsanalyser utfördes som tidigare beskrivna76,77,78. I detalj fylldes en 400 mL glasbägare (7,5 cm innerdiameter) med 300 mL vatten, och en 10 ml droppe paraffinlampolja tillsattes och fick spridas i en tunn film på vattenytan under en 5 min period (~25 mm i diameter). Lösningar av ytaktin, renad clostrienos och en kaliumfosfatbuffertkontroll bereddes vid det angivna pH och koncentrationen (framställd i 10 mM kaliumfosfatbuffert). Cirka 10 occyl prov tillsattes försiktigt i mitten av oljefilmen och effekten på oljefilmen observerades. Prover med ytaktiv aktivitet förväntas bilda stabila cirkulära rensningszoner i oljefilmen, med mer potent ytaktiv aktivitet motsvarande större rensningszoner (eller fullständig dispersion av oljefilmen för mycket hög ytaktiv aktivitet). Fallkollapsanalyser utfördes77,79, 80. Cirkulära mikrobrunnar (8 mm innerdiameter) i polystyrenlocket på en 96-mikrobrunnsplatta (12,7 8,5 cm) belades med ett tunt lager av paraffinlampolja genom att tillsätta 2,0 ml paraffinlampolja till varje brunn och låta droppen sprida sig jämnt över mikrobrunnen under en 1 h-period. Prover av ytaktin, renad clostrienos och kaliumfosfatkontroll bereddes som för oljespridningsanalyserna. Cirka 5 occyl prov tillsattes försiktigt till mitten av mikrobrunnen. Efter 5 min observerades formen och graden av spridning av droppen. Medan buffertkontroller förväntas bilda stabila pärlor på microwell-ytan, förväntas prover som innehåller ytaktivt ämne kollapsa och spridas över microwell-ytan, med mer potent ytaktivt aktivitet motsvarande en högre grad av droppspridning.

rening och in vitro-analys av PKS-protein

för att rena det His6-märkta PKS-proteinet för in vitro-analys transformerades pET24b_pks till E. coli BAP1. En enda koloni inokulerades i 10 mL LB + 50 oc/mL kanamycin (Kan) för tillväxt över natten vid 37 oc C. Cirka 7 mL nattkultur användes för att inokulera 700 mL LB + 50 oc/mL Kan, och kulturen skakades vid 240 rpm och 37 oc C tills den nådde OD600 av 0,5. Efter isbildning av kulturen i 10 min tillsattes isopropyl thio-Bisexuell-d-galaktosid (IPTG) till en slutlig koncentration av 0.1 mM för att inducera proteinuttryck, och odlingen inkuberades vid 16 kg C under 16 timmar. cellerna skördades genom centrifugering (5500 kg C, 4 kg C, 20 min), återsuspenderades i 25 mL lysbuffert (25 mm HEPES, pH 8,0, 0,5 M NaCl, 5 mm imidazol) och lyserades genom homogenisering över is. Cellskräp avlägsnades genom centrifugering (17,700 xnumx xnumx kg, 4 xnumx xnumx C, 60 min) och ni-nta agarosharts tillsattes till supernatanten (2 mL/L-kultur). Blandningen nuterades vid 4 C i 1 h, laddades på en gravitationsflödeskolonn och PKS-proteinet eluerades med ökande koncentrationer av imidazol i buffert A (20 mm HEPES, pH 8,0, 1 mM DTT). Renat PKS-protein koncentrerades och buffert utbyttes till Buffert A + 10% glycerol med användning av en Vivaspin Centrifugalkoncentrator. Alikvoter av renat PKS-protein alikvoterades och flash frystes i flytande kväve. Det ungefärliga proteinutbytet var 5 mg / L (203 kDa).

en PKS-laddningsanalys med 14C-märkt substrat innehöll, i en total volym av 15 oc, 4 mM ATP, 2 mM MgCl2, 1 mM TCEP, 0.5 mM CoA, 2-14C-malonsyra (0,1 occurci), 10 occurm MatB, 17 occurm PKS och 50 mm HEPES, pH 8,0. Efter 2 h inkubation vid 25 c c, proverna släcktes genom tillsats av en lika stor volym av 1 SDS-provbuffert. Efter SDS-SIDANALYS med en 4-15% TGX-gel (kriterium) torkades gelen i 2 timmar vid 50 kg C och exponerades på en lagringsfosforskärm (20 kg 25 cm; molekyldynamik) i 5 dagar. Radioaktivt märkt protein avbildades på en Typhoon 9400 phosphorimager (Lagringsfosforläge, 50 occurm upplösning; Amersham Biosciences).

för in vitro-produktanalyser (50 oc) av PKS-proteinet inkuberades 8 oc PKS med malonyl-CoA (2 mM) i fosfatbuffert (100 mM, pH 7,0) vid rumstemperatur i 2 timmar för att generera förening 4, identifierad genom jämförelse med en kemisk standard. NADPH (2 mM) tillsattes till analysen för att generera föreningar 5 och 6, vilka båda identifierades genom jämförelse med kemiska standarder. Efter inkubation extraherades analysblandningarna två gånger med 100 oktyl 99% etylacetat/1% ättiksyra (v/v). De organiska extrakten torkades och resuspenderades i 100 oc metanol och 10 oc injicerades på ett Agilent Technologies 6120 Quadrupole LC-MS (med DAD) instrument utrustat med en Agilent Eclipse Plus C18-kolonn (4,6 oc 100 mm). En linjär gradient av 2-98% CH3CN (vol/vol) över 40 min i H2O med 0,1% myrsyra (vol/vol) vid en flödeshastighet av 0,5 mL/min användes. LC-HRMS-analys av analysextrakten utfördes på ett Agilent Technologies 6520 exakt massa QTOF LC-MS-instrument utrustat med en Agilent Eclipse Plus C18-kolonn (4.6 100 mm) med användning av samma lösningsmedelsgradient och flödeshastighet som beskrivits ovan.

datatillgänglighet

RNA-seq-data som genererats i denna studie har deponerats i ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) under anslutningsnummer E-MTAB-6019. Alla andra relevanta uppgifter är tillgängliga från författarna på begäran.