ClpP-proteasaktivering resulterar från omorganisationen av de elektrostatiska interaktionsnätverken vid ingången porer

Bindningsläge för ACP1 till EcClpP

för att belysa den strukturella grunden för ClpP-aktivering med ACP128, strukturer av NmClpP och EcClpP (Fig. 1a) i komplex med ACP1-analoger söktes. Medan en struktur av NmClpP med bunden ACP1 inte uppnåddes trots upprepade försök, bestämdes en struktur av EcClpP+ACP1-06-komplexet till 1,9-upplösning (Fig. 1b, C, Tabell 1), innehållande en tetradekamer i den asymmetriska enheten (kedjorna A-N). Elektrontäthet för N-terminala rester som bildar ecclpps axiella slingor är oklart i alla utom en subenhet (kedja B). I tidigare publicerade strukturer är dessa axiella slingor mycket flexibla och är vanligtvis störda i Kristallen i frånvaro av aktivatorer eller genom uteslutning genom kristallförpackning23. Otvetydig elektrontäthet observerades för en enda ACP1-06-molekyl i en ficka bildad av underenheter D och E, som visar två olika konfigurationer av föreningen (Fig. 2a, b). Båda konfigurationerna modellerades i elektrondensiteten, i vilken den första konfigurationen placerar trifluormetylpyridindelen av föreningen i en hydrofob ficka (nedkonfiguration), medan den andra placerar den ur den hydrofoba fickan utsatt för lösningsmedel (upp konfiguration) (Fig. 2a). De återstående 13 hydrofoba fickorna visar tvetydig elektrondensitet för ACP1-06. Vi modellerade och förfinade alla 14 ACP1-06-molekyler i både upp-och nedkonfigurationer vid beläggning av 0.5, vilket resulterade i förbättrad elektrontäthet för varje ligand.

bindningslägena för ACP1-06 (Fig. 2B-d) approximera de av ADEPs som observerats i kristallstrukturer av olika bakteriella ClpPs (Fig. 2c-f) 6,15,18,19,21,40. Observera att föreningar som syntetiseras av vår grupp är numrerade som ACP1-YY och ADEP-YY, medan föreningar från studier av andra grupper heter som i respektive publicerade artiklar. Alla proteinkontakter med ACP1-06 är icke-polära i naturen förutom två anmärkningsvärda elektrostatiska bindningar som uppstår mellan (1) den fenoliska hydroxylsidokedjan av Y76 och amidsyret av ACP1-06 och (2) guanidinylsidokedjan av R206 (den näst sista Arg i EcClpP) och ett sulfonylsyre av ACP1-06 (Fig. 2b). De senare två interaktionerna är närvarande i båda konfigurationerna av ACP1-06. Dessutom stabiliseras R206 (kedja E) genom jonbindning med E65 i en intilliggande underenhet (kedja D) (Fig. 3a, b).

i nedkonfigurationen upptar trifluormetylpyridindelen av ACP1-06 ett hydrofobt hålrum bildat av L62, T93 och F96 (kedja D) och Y74, Y76, i104, L203 och L128 (kedja E) (Fig. 2b och 3b). Detta är samma hålighet som upptas av ringen av den exocykliska Phe-återstoden av de olika ADEP-analogerna cocrystallized med ClpP, såsom i vår NmClpP+ADEP-0419 (Fig. 2e, f) eller ecclpp+ADEP1-strukturerna40 (Fig. 2c, d). Däremot roteras trifluormetylpyridindelen i UP-konfigurationen runt C – s-bindningen och exponeras lösningsmedel medan van der Waals gör kontakter med Y74, i104, F126 och L203 (kedja E) (Fig. 2b och 3b). Gem-dimetyldelen staplar mot den plana ringen av Y74 (kedja E), medan den förlängda alifatiska kedjan avslutas med en Orto-klor-substituerad fenylring, sitter i ett icke-polärt spår mellan två spiraler från intilliggande underenheter (Fig. 3b). Denna bindande klyfta bildas av L62 (kedja D), F63 (kedja D), A66 (kedja D), L37 (kedja E), V42 (kedja E) och den icke-polära delen av E40 (kedja E) (Fig. 2b och 3b).

i både ACP1-06 – och ADEP1-bundna strukturer av EcClpP finns intrasubunitsaltbryggan mellan R36 och E40, där den närliggande alifatiska svansen av ADEP1 eller den klorsubstituerade fenylringen av ACP1-06 bildar en hydrofob interaktion med sidokedjan av E40 (Fig. 3b, c). De två aktivatorerna stabiliseras ytterligare på det hydrofoba stället med två distinkta vätebindningsmönster. Medan ACP1-06 säkras genom en lösningsmedelsexponerad jonisk interaktion mellan dess sulfonylgrupp och den C-terminala r206-återstoden (Fig. 3B), ADEP1 hålls på plats av två vätebindningar med hydroxylgruppen Y76 avskild inom det hydrofoba stället (Fig. 3c). En lösningsmedelsmedierad vätebindning mellan E65 och karbonylgruppen i n-acyl Phe-sidokedjan av ADEP1 stärker ytterligare dess interaktion med EcClpP (Fig. 3c). Denna extra vätebindning, såväl som den större storleken på den cykliska depsipeptidringen, som har mer ytarea för att bilda van der Waals-interaktioner jämfört med den mindre trifluormetylpyridingruppen av ACP1, kan redogöra för den generellt stramare bindningen som observerats för ADEPs än ACP1s28.

i ecclpp+ACP1-06-strukturen fann vi en oförklarlig elektrontäthet i alla 14-subenheter som sträcker sig från den nukleofila återstoden S111 i den katalytiska triaden, vilket tyder på en kovalent modifiering (kompletterande Fig. 1a, b). Tätheten sträcker sig i ungefär rät vinkel i motsatta riktningar bort från S111-sidokedjorna. Trots omfattande ansträngningar kunde det inte övertygande utrustas med peptider, acylketonprodukter eller olika kända serinproteashämmare molekyler.

BINDNINGSLÄGE för ADEP till NmClpP

NmClpP har en kortare Pro-sekvens vid N-terminalen, medan den har fyra extra rester vid C-terminalen jämfört med EcClpP (Fig. 1a). Även om NmClpP uttrycktes som ett fullängdsprotein som bär en N-terminal His6-tagg, observerade vi upprepade gånger brist på bindning till ni-nitrilotriättiksyrahartset. N-terminal sekvensering av det renade proteinet avslöjade att den mogna NmClpP börjar vid Rest Y6 (Fig. 1A), vilket indikerar autoproteolys för att frigöra sin N-terminala pro-sekvens (1msfdn5).

tidigare hade vi bestämt strukturen för NmClpP med ADEP-0419. I denna studie bestämde vi strukturen för apo-NmClpP till 2,0 kg och Nmclpp med bunden ADEP – 14 till 2,7 kg (Fig. 1b, C, kompletterande Fig. 1C, Tabell 1). Strukturen för apo-NmClpP innehåller en tetradekamer i den asymmetriska enheten och visar ingen klar densitet för någon av de 14 N-terminala axiella slingorna. Svag elektrontäthet observeras för slingorna som bildas av rester G133-G137 i stränga2 i handtagsområdet (Fig. 1a). Den asymmetriska enheten för nmclpp + ADEP-14-kristallen innehåller två tetradecamers (kompletterande Fig. 1d). Ingen elektrontäthet observerades för rester 1-22 av alla 28 underenheter på grund av kristallförpackning (Fig. 1C, kompletterande Fig. 1d). Dessutom, den 20-sträng (rester 130-137; Fig. 1a) är endast delvis synlig i alla underenheter. ADEP – 14 är bunden till NmClpP i en liknande konfiguration som ADEP-04 (Fig. 2e, f och 3e, f). Kortfattat upptar DIFLUORFENYLDELEN av ADEP-14 en hydrofob ficka bildad av Y67, L95, L97 och L119 av en subenhet och V49, L53, T84 och F87 av en intilliggande subenhet (Fig. 3e). Den sexledade ringen av pipekolsyradelen är lösningsmedelsexponerad och stabiliseras av fenylringen av F117 och de hydrofoba sidokedjorna av L97, L119 och L196 (Fig. 3e). Den ytterligare metylsubstitutionen på allotreoninresten i depsipeptidringen (Fig. 1b) är lösningsmedelsexponerad. Liksom ADEP-04 säkras ADEP-14 i den mycket komplementära hydrofoba fickan genom två vätebindningsinteraktioner mellan den fenoliska hydroxylgruppen av Y67, aminogruppen i difluorfenylalanin-återstoden och alanin-karbonylgruppen i depsipeptidringen och en lösningsmedelsmedierad vätebindning med E56 (Fig. 3e, f). Den oktadiensyra sidokedjan av ADEP – 14 är belägen i den smala hydrofoba kanalen bildad av L53, F54 och S57 av en subenhet och R27, L28, E31, I33, F35 och Y67 i den angränsande subenheten (Fig. 3e).

ACP1 – och ADEP-bindande resultat i distinkta allosteriska effekter på ClpP – tunnan

med användning av strukturer av apo-och föreningsbundna former av EcClpP och NmClpP (Fig. 1c), undersökte vi de allosteriska effekterna som uppstår vid aktivatorbindning. Såsom visas i kompletterande Fig. 2, aktivatorbindning fungerar som en kil som orsakar sidoförskjutning av två intilliggande underenheter. Omfattningen av den globala konformationsförändringen orsakad av acp1-06-bindning (rmsd = 0,84 Macau i förhållande till apo-EcClpP) liknar den för ADEP-04 (rmsd = 0.73 kg i förhållande till apo-Nmclpp), men mindre än för ADEP-14 (rmsd = 2,47 kg i förhållande till apo-NmClpP). Intressant är förskjutningsriktningen olika mellan de två klasserna av aktivatorer (kompletterande Fig. 2 och kompletterande filmer 1-4). Mellan de två Adepsen orsakar ADEP-14 en större övergripande strukturell störning till nmclpp-cylindern (jämför kompletterande Filmer 3 vs. 4). ADEP-bindning resulterar i en expansion av den apikala ytan av NmClpP åtföljd av förträngning vid ekvatorialregionen. Vridningen för denna rörelse är i handtagsområdet som består av helix AE och sträng 208. Detta fenomen observeras i alla ADEP-bundna ClpP-strukturer som hittills är kända, med varierande grad av komprimering av ClpP-cylindern15,18,19,23,40. Däremot orsakar acp1-06-bindning till EcClpP en inåtgående rörelse av alla underenheter vilket resulterar i åtdragning av ClpP-cylindern (kompletterande Film 1). Således visar strukturerna att ACP1s och ADEPs aktiverar ClpP genom att inducera distinkta allosteriska effekter.

i de aktivatorbundna ecclpp-och NmClpP–strukturerna förblir de elektrostatiska bindningarna som stabiliserar tetradekameren bevarade trots konformationsförändringarna (kompletterande Fig. 3). Dessutom, trots den globala strukturförändringen vid aktivatorbindning, ser-His-asp katalytiska triader av EcClpP och NmClpP upprätthåller katalytiskt kompetenta geometrier eftersom endast mindre ca-ryggradsskift inträffar nära det aktiva stället (kompletterande Fig. 1a-c). Analys av alla befintliga ACP1-och ADEP-bundna strukturer av ClpP visar att föreningsbindning också resulterar i sammandragningen av ekvatorialregionen (kompletterande Fig. 4).

vi kvantifierade packningen av ClpP-cylindern vid ACP1-eller ADEP-bindning genom att mäta volymerna för respektive katalytiska kamrar (kompletterande Fig. 4). Acp1-06-bindning orsakar en ~5% minskning av den katalytiska kammarvolymen relativt apo-EcClpP. ADEP1-bindning till EcClpP resulterar i en liknande minskning av katalytisk kammarvolym. Detta observeras också för andra aktivatorbundna ClpP-strukturer såsom ADEP-14-bunden NmClpP, ADEP-bunden BsClpP och ADEP-bunden MtClpP1P2 heterooligomer komplex (kompletterande Fig. 4).

ClpP-aktivering resulterar i omorganisationen av det elektrostatiska bindningsnätet vid de axiella porerna

i strukturen av apo-NmClpP stabiliserar två elektrostatiska bindningar nära den axiella porerna gränssnittet för två intilliggande underenheter (Fig. 3D, kompletterande Fig. 5). För det första bildar den negativt laddade E58-karboxylatgruppen i en subenhet ett jonpar med den positivt laddade R27-guanidiniumgruppen i den intilliggande subenheten. För det andra bildar S57 hydroxyl-och E31-karboxylatgrupperna av två intilliggande underenheter en vätebindning. Vid ADEP-bindning bryts dessa två icke-kovalenta bindningar, medan jonbindningen mellan R27 och E31 av samma subenhet förkortas, d.v. s. förstärkt (Fig. 3e, f). I apo-EcClpP länkar endast en jonbindning mellan E67 och R36 två intilliggande underenheter, eftersom motsvarande rest till S57 av NmClpP är en alanin i EcClpP och således inte kan bilda en vätebindning med E40 (Fig. 3a). Som i NmClpP eliminerar bindning av ACP1 eller ADEP1 till EcClpP intersubuniten E67-R36 jonbindning och ger upphov till en starkare intrasubunitjonbindning mellan R36 och E40 (Fig. 3b, C, kompletterande Fig. 5).

för att ytterligare verifiera dessa observationer designade vi nmclpp-och EcClpP-punktmutanter som leder till förlust av ovanstående elektrostatiska bindningar mellan subenheter. Såsom visas i Fig. 4a, medan WT NmClpP inte kunde bryta ner proteinkaseinet, befanns nmclpp e58a-mutanten bryta ner kasein i högre takt än e31a-mutanten. Viktigt är att den dubbla mutanten E31A + E58A hade en ännu högre aktivitet än de enskilda mutanterna. Omfattningen av aktiveringen av den dubbla mutanten NmClpP liknar den som observerats i närvaro av 1 kg ADEPs eller 10 kg acp1s (Fig. 4a). Liknande beteende observerades för EcClpP med liknande mutationer (E40A och E67A; Fig. 4b). Respektive EcClpP-dubbelmutant är inte löslig och kunde inte testas.

därefter bestämde vi Röntgenstrukturer av nmclpp e58a och NmClpP e31a + e58a mutanter (Tabell 1). De katalytiska platserna i båda mutanterna störs inte (Kompletterande Fig. 1e). I nmclpp e58a singelmutant avskaffar mutationen intersubenheten E58-R27 jonbindning och ger upphov till en starkare intrasubenhet R27–E31-interaktion, medan vätebindningen mellan S57 och E31 förblir (Fig. 4c). En liknande ”kileffekt” observeras således i strukturen, vilket visas av den subtila globala konformationsförändringen i nmclpp-mutantens Ca-ryggrad (rmsd = 0,33 kcal i förhållande till WT NmClpP) (kompletterande Film 5). Mutation av både E31 och E58 till alanin för att generera den dubbla mutanten NmClpP E31A + E58A (rmsd = 0,29 kcal i förhållande till WT NmClpP) avskaffar de två stabiliserande intersubenhetens elektrostatiska interaktioner, såväl som intrasubenheten R27–E31 jonbindning närvarande i nmclpp e58a singelmutant (Fig. 4D och kompletterande film 6) och i ADEP-bunden NmClpP (Fig. 3e, f). Således är nmclpp e31a + E58A dubbelmutant till skillnad från ADEP-bunden NmClpP med den eliminerade intrasubunitjonbindningen men är ändå ett aktiverat protein med inneboende proteolytisk aktivitet jämförbar med den hos Småmolekylaktiverad ClpP (Fig. 4a). Liksom ADEP-bunden NmClpP har både nmclpp enkel-och dubbelmutanter minskat katalytiska kammarvolymer på grund av ClpP-fatkomprimering (kompletterande Fig. 4).

sådan omorganisation av bindningsnätet observeras för alla aktiverade ClpP-strukturer som finns tillgängliga i PDB, vare sig i närvaro av småmolekylära aktivatorer eller på grund av specifika mutationer (kompletterande Fig. 6). Till exempel, små molekyl aktivator bindning till B. subtilis ClpP (BsClpP), S. aureus ClpP (SaClpP), M. tuberculosis ClpP (MtClpP), och Homo sapiens ClpP (Hsclpp) avskaffar en eller två intersubunit elektrostatiska bindningar nära den axiella poren, och ger upphov till en starkare, intrasubunit jonisk interaktion (kompletterande Fig. 6a-e, g-l) 6,15,18,21,39. I MtClpP2 existerar inte intersubenhetsjonbindningen ekvivalent med E58-R27-interaktionen i Nmclpp18. Den ekvivalenta återstoden för E58 av NmClpP är L66 i MtClpP2 och kan inte delta i en jonisk interaktion med K35 av MtClpP2 (motsvarande R27 av NmClpP). Istället stabiliserar en intersubenhet vätebindning mellan S65 och E39 gränssnittet (kompletterande Fig. 6g, h). ADEP-bindning till MtClpP2 bryter S65-E39-vätebindningen och stärker intrasubunitjonbindningen mellan K35 och E3918.

intressant är att även den aktiverade SaClpP Y63A-varianten 41, Med den aktiverande mutationen som finns i mitten av den hydrofoba platsen, och därför inte motsvarar de aktiverande mutationerna av NmClpP som presenteras här, stöder vår föreslagna modell av omorganisationen av vätebindningsnätet runt den axiella poren vid ClpP-aktivering (kompletterande Fig. 6f). I strukturen hos SaClpP Y63A-mutanten ökas avståndet mellan intersubunitjonparet (Q54–R23), medan intrasubunitsaltbroen (R23–D27) stärks (kompletterande Fig. 6d, f). Vi genererade också motsvarande y63a-mutation i både EcClpP och NmClpP. Nmclpp Y67A-mutanten var olöslig, medan EcClpP Y76A hade en aktivitet något högre än e40a-mutanten, men lägre än den för e67a-mutanten (Fig. 4b).

ClpP-aktivering resulterar i minskning av strukturell heterogenitet hos de N-terminala axiella slingorna

som diskuterats ovan, i den beställda axiella slingan i nmclpp+ADEP–04-komplexet som bildar hårnålsvridningen för hårnålen1-XX2, frisätter ADEP-bindning R27 från en intersubunitjonbindning med E58 och stärker intrasubunitjonbindningen med E31 av helix aA (Fig. 5a). Följaktligen bildar R27 en jonbindning med D23 av sträng av den axiella slingan. Denna stabiliserande interaktion observeras i alla aktivatorbundna strukturer av ClpP där de axiella slingorna är ordnade (Fig. 5a-e).

för ecclpp + ACP1-06-strukturen beställs de axiella öglorna (rester 14-31) delvis i kristallen med endast 1 av 14 axiella öglor som bildar hårnålsvridningen 2-1 (Fig. 1c-fullständig beställning verkar delvis förhindras av kristallpackningseffekter). I den ordnade axiella slingan av subenhet A tillåter frisättning av R36 från intersubunitjonbindningen med E67 att den bildar en starkare intrasubunitjonbindning med E40 av helix aA (Fig. 5f). Det finns emellertid ingen stabiliserande joninteraktion mellan E22 av stränga21 och R36 av helix aA, troligen på grund av partiell beställning (Fig. 5f). En ytterligare vätebindning mellan D32 av strängen2 och S21 av helix aA förankrar den axiella slingan till EcClpP-kärndomänen (Fig. 5f). På samma sätt är de axiella slingorna i Enterococcus faecium ClpP (EfClpP)-ADEP4-strukturen endast delvis beställda21. Den konserverade vätebindningen mellan Arg-återstoden av helix aA och en negativt laddad återstodstråd av strängen1 ses inte i de delvis ordnade EfClpP-axiella slingorna, även om EfClpP har potentiella vätebindningsbildande rester på strängen1 (T6) och på slinganslutningssträngarna 61 och 22 (E9, Q10, S11, S12, E15) (Fig. 5g).

förutom konserverade elektrostatiska interaktioner stabiliserar omfattande hydrofoba kontakter med ClpP-huvuddomänen de axiella öglorna. I EcClpP+ACP1-06 deltar icke-polära N-terminala rester av sträng 21 och den föregående strukturerade spolen i hydrofoba interaktioner med icke-polära rester av helix aA av samma subenhet och på de hydrofoba ytorna på spiraler aA’ och aB’ i en angränsande subenhet (kompletterande Fig. 7a). De icke-polära resterna på spiraler aA, aB’ och 2B3′ utgör en kontinuerlig hydrofob lapp på omkretsen av den axiella poren (kompletterande Fig. 7b) 15.

för att få en tydligare bild av den konformationella heterogeniteten hos ClpP-axiella slingor utfördes sedan metyl-TROSY NMR-experiment. Initialt infördes en enda cysteinmutation i axiella slingor av NmClpP(T10C). Enhetligt deutererat protein producerades och reagerades därefter med 13C-metylmetantiosulfonat (MMTS). Detta resulterar i fastsättning av en enda NMR synlig 13ch3–s-grupp till cysteinsidokedjan, vilket leder till bildning av en s-metyltio-cystein (MTC) återstod42. Denna metod ger ett enkelt sätt att övervaka strukturen och dynamiken hos stora komplex i lösning. Övervakning av NMR-korrelationerna hos den bifogade spinnproben i fria, aktivatorbundna eller muterade former av enzymet ger en avläsning av lösningskonformationen hos de axiella porerna.

initialt utfördes kontrollexperiment för att säkerställa att introduktionen av t10mtc-delen inte stör strukturen hos NmClpP. Kortfattat, 1H-13C heteronukleär multipel kvantkoherens (HMQC) korrelationer av WT och T10MTC NmClpP märkt 13CH3 vid sidokedjan av ILVM-rester i en annars fullständigt deutererad bakgrund jämfördes och befanns vara praktiskt taget identiska. Därefter erhölls 1H-13C HMQC-korrelationer av NmClpP T10MTC i olika tillstånd (Fig. 6a). Apo-formen (blå konturer) har ett stort antal korrelationer, vilket indikerar strukturellt heterogena axiella slingor. Tillägg av tvåfaldigt molärt överskott av ADEP-28 (aktivitet ges i Fig. 4a) över monomer ClpP minskade signifikant antalet korrelationer (röda konturer), vilket indikerar stelning eller strukturell ordning. Däremot acp1-17-bindning (tvåfaldigt molärt överskott över monomer ClpP; aktivitet ges i Fig. 4a) resulterar i odetekterbara förändringar i de observerade korrelationerna (gröna konturer), vilket innebär att de axiella slingorna inte påverkas.

detta tillvägagångssätt utnyttjades också för att övervaka effekten av aktiverande mutationer (Fig. 4a, b) på axiella slingor. I dessa experiment infördes de aktiverande mutationerna i bakgrunden av t10c (märkning) mutationen. Såsom visas i Fig. 6A, korrelationer av nmclpp t10mtc/E31A mutant (röda konturer) är något mindre heterogena än pseudo WT-formen, medan de av nmclpp t10mtc/E58A mutant (orange konturer) är praktiskt taget oförändrade. Den samtidiga närvaron av båda aktiverande mutationerna (NmClpP T10MTC/E31A + E58A) har en mycket mer dramatisk effekt än enstaka mutationer och tar bort ett stort antal korrelationer som motsvarar axiella slingor (svarta konturer). Detta överensstämmer med observationen att den dubbla mutanten är mer aktiv än de enskilda mutanterna (Fig. 4a).

ClpP-aktivering resulterar i minskning av konformationell heterogenitet i handtagsregionen

samma NMR-baserade tillvägagångssätt användes för att undersöka effekten av aktivatorbindning och mutationer på handtagsregionen. En i144mtc (helix ae) mutant av NmClpP bereddes och studerades av NMR i apo-, ADEP-28-och ACP1-17-bundna former. Apo-formen (blå konturer, Fig. 6a) uppvisar ett par toppar, vilket indikerar att handtagsregionen är associerad med ett par samexisterande konformationer, vilket framgår av vårt tidigare arbete med EcClpP4. Intressant nog leder tillägg av ACP1 och ADEP till att en av topparna försvinner. Med tanke på att aktivatorbindningsstället är distalt mot NMR-spinnproben, verkar det som att ACP1-eller ADEP-bindning allosteriskt väljer för en av konformationerna i handtagsområdet. Alternativt kan aktivatorer kunna binda båda formerna men inducera en förändring till ett enda tillstånd.

Magnetiseringsutbytesexperiment med blandningsfördröjningsperioder av 100, 200, 300, 400, 500, och 600 ms vid 40 kcal C kunde inte detektera någon interkonversion mellan de konformatorer som observerades för handtagsregionen för WT NmClpP. Detta indikerar att utbytesprocessen är för långsam för karakterisering av NMR.

SAXS demonstrerar aktivatorinducerad ClpP-konformationsförändringar i lösning

för att ytterligare undersöka oligomera tillstånd och strukturella förändringar vid förening bindning, apo-NmClpP och NmClpP+ADEP-04 prover kännetecknades av SAXS (Fig. 6b-g och kompletterande Fig. 8). Slutliga sammanslagna kurvor visas i Fig. 6b, och de erhållna saxsprofilerna liknade de av ihåliga strukturer43. Inga signifikanta förändringar hittades när det gäller total vikning (kompletterande Fig. 8), gyrationsradie (Rg) och oligomeriskt tillstånd när ADEP-04 tillsattes till NmClpP (kompletterande Fig. 8c). För att ytterligare analysera nmclpp SAXS-profilerna och generera solution ab initio-strukturer användes GNOM-programmet för att konstruera pardistansfördelningsfunktioner, p(r). Apo-NmClpP p (r) avslöjade en subtil högerskift och större maximal dimension (Dmax) jämfört med ADEP-04-bunden NmClpP (Fig. 6c och kompletterande Fig. 8c). Därefter genererades dummyatommodeller (dammar) med användning av SAXS-data för att visuellt analysera nmclpp-lösningsstrukturer (Fig. 6d-g). Tio modeller genererades för apo-NmClpP och ADEP-04-bunden NmClpP, och de mest troliga valdes. Dessa modeller visade att de två nmclpp-lösningsstrukturerna totalt sett är likartade (ihåliga cylindrar). Men när de överlagrades med motsvarande kristallstrukturer observerades skillnader som överensstämmer med högupplösta strukturer lätt (Fig. 6d, e). Ett mått på axialhöjderna för alla tio dammar för apo-och ADEP-04-bunden NmClpP resulterade i värden på 93,0 5,4 5,4 för apo-formen och 103,5 6,1 6,1 för ADEP-04-bunden form. För att ytterligare bekräfta denna observation, medelvärdes dammar sannolikhetskartor och högsta das beläggning kartor (Fig. 6F, g) analyserades. De axiella höjderna visade en ökning med cirka 10 kcal för ADEP-04-bunden nmclpp i jämförelse med apo-nmclpp. Dessutom visade ADEP-04-bunden NmClpP en större axiell poromkrets än apo-NmClpP (Fig. 6f, g). Således, trots den låga upplösningen av SAXS-tekniken, tyder resultaten på att ADEP – 04-bindning till NmClpP inte påverkar nmclpps oligomera tillstånd utan orsakar en expansion av de axiella porerna och ökad beläggning vid de övre och nedre delarna av NMCLPP+ADEP-04-dammen (Fig. 6e, g) jämfört med apo-NmClpP. Detta återspeglar sannolikt konformationsförändringar som leder till minskad heterogenitet av strukturen hos N-terminala axiella slingor av NmClpP observerad av röntgen och NMR.