Clemizol och modulatorer av serotoninsignalering undertrycker anfall i Dravet syndrom

Abstrakt

Dravet syndrom är en katastrofal barndomsepilepsi med tidiga anfall, försenad språk-och motorisk utveckling, sömnstörningar, ångestliknande beteende, allvarligt kognitivt underskott och ökad risk för dödsfall. Det orsakas främst av de novo-mutationer av SCN1A-genen som kodar för en neuronal spänningsaktiverad natriumkanal. Zebrafisk med en mutation i SCN1A-homologen rekapitulerar spontan anfallsaktivitet och efterliknar de konvulsiva beteenderörelser som observerats i Dravet syndrom. Här visar vi att fenotypisk screening av läkemedelsbibliotek i zebrafisk scn1 mutanter snabbt och framgångsrikt identifierar nya terapier. Vi visar att clemizol binder till serotoninreceptorer och dess antiepileptiska aktivitet kan efterliknas av läkemedel som verkar på serotoninsignalvägar, t.ex. trazodon och lorcaserin. I samband med dessa zebrafiskfynd behandlade vi fem medicinskt otänkbara Dravet-syndrompatienter med en kliniskt godkänd serotoninreceptoragonist (lorcaserin, Belviq Jacobsen) och observerade några lovande resultat när det gäller minskningar av anfallsfrekvens och/eller svårighetsgrad. Våra resultat visar en snabb väg från preklinisk upptäckt i zebrafisk, genom målidentifiering, till potentiella kliniska behandlingar för Dravet syndrom.

introduktion

barndomsepilepsier klassificerade som katastrofala är ofta förknippade med en genetisk mutation. Bland dessa har Dravet syndrom kopplats till mer än 600 de novo-mutationer i en enda gen, SCN1A (Catterall et al., 2010; Escayg et al., 2010). Barn som lider av Dravet syndrom uppvisar anfall som börjar så tidigt som 6 månaders ålder, försenad språk-och motorisk utveckling, sömnstörningar, ångestliknande beteende och allvarligt kognitivt underskott (Dravet, 2011). Symtom på autismspektrumstörning har också rapporterats (Li et al., 2011) och risken för plötslig oförklarlig död med epilepsi (SUDEP) i denna population uppskattas till 15 gånger högre än andra barndomsepilepsier (Kearney, 2013). Tillgängliga antiepileptika erbjuder inte tillräcklig anfallskontroll och resektiva neurokirurgiska ingrepp är vanligtvis inte ett alternativ. Nya behandlingar för Dravet syndrom är fortfarande ett viktigt ouppfyllt behov trots en viss effektnivå i begränsade kliniska prövningar för cannabidiol (Epidiolex Macau) och stiripentol (diacomit Macau), som kan associeras med kognitiva eller aptitsäkerhetsproblem (Perez et al., 1999; Chiron et al., 2000; Detyniecki et al., 2016; Devinsky et al., 2016).

mutationer i SCN1A, en gen som kodar för den porbildande Macau-subenheten i en spänningsstyrd natriumkanal (Nav1.1), har identifierats hos nästan 85% av patienterna med Dravet syndrom (Dravet, 2011). Nav1.1-kanaler bidrar till snabb depolarisering av neuronala membran som ses under aktionspotentialgenerering (Hodgkin et al., 1952). Möss som är heterozygota för en funktionsförlustmutation i Nav1.1 utvecklar spontana och temperaturkänsliga anfall tidigt i livet och dör för tidigt runt postnatal dag 25 (Yu et al., 2006; Oakley et al., 2009; Cheah et al., 2012). Akuta elektrofysiologiska studier i dessa och relaterade Scn1a-bristfälliga möss föreslår en minskning av natriumströmdensiteten och en associerad minskning av avfyrningsaktiviteten för en subpopulation av GABA-Uttryckande hämmande neuroner (men inte excitatoriska huvudceller) som kulminerar i minskad synaptisk hämning och nätverkshyperexcitabilitet (Yu et al., 2006; Kalume et al., 2007; Han et al., 2012). Denna’ interneuronopati ’ – hypotes överensstämmer med andra former av katastrofala barndomsepilepsier och bekräftades hos möss där Scn1a selektivt raderades från parvalbumin – eller somatostatin-Uttryckande interneuron-subpopulationer (Dutton et al., 2013; Tai et al., 2014). Autistiska beteenden rapporterades också hos dessa möss (Han et al., 2012). Intressant är att initiala studier på humana excitatoriska och hämmande neuroner härledda med inducerad pluripotent stamcellsteknik från två patienter med Dravet syndrom rapporterade underskott i spänningsaktiverad natriumström för båda celltyperna, vilket tyder på antingen homeostatisk kompensation för tidig förlust av funktion av en kritisk hjärnspecifik natriumkanal eller ytterligare mekanismer som bidrar till den epileptiska fenotypen som observerats hos dessa patienter (Jiao et al., 2013; Liu et al., 2013).

även om möss och humana inducerade pluripotenta stamceller härledda neuroner bidrar till vår förståelse av den underliggande patofysiologin för Dravet syndrom, är dessa system inte väl lämpade för snabb identifiering av nya terapier på grund av variationen i dessa modeller och reproducerbarhet av kvantitativa mätningar. Som zebrafisk är en idealisk ryggradsdjur modellsystem för att utföra små molekyler fenotyp-baserade skärmar (MacRae et al., 2015), och är mottagliga för genetiska manipuleringar, fokuserade vi våra ansträngningar på en zebrafisknatriumkanalmutant. Zebrafisk mutanter hyser en förlust av funktion missense mutation i SCN1A orthologue, scn1Lab, identifierades i en mutagenes skärm (Schoonheim et al., 2010). På grund av en förfaderlig helgenomdubbling är zebrafisk scn1Lab− mutanter haploinsufficient för Nav1.1 och analog med Scn1a+/ – möss eller patienter med Dravet syndrom. Konvulsiva beteenden och episoder av kort interictal och långvarig polyspike ictal-liknande elektrografisk urladdning observeras i mutanta larver så tidigt som 3 dagar efter befruktning (dpf) med progression till mer robusta anfallsfenotyper mellan 4 och 7 dpf (Baraban et al., 2013; Hong et al., 2016). Mutanta larver dör för tidigt, uppvisar metaboliska underskott (Kumar et al., 2016), och är resistenta mot många antiepileptika (AED) (Dinday et al., 2015). I likhet med den kliniska hanteringen av Dravet-syndrom kan viss dämpning av anfallsaktivitet erhållas med valproat, bensodiazepiner, bromider, stiripentol samt en ketogen diet (Baraban et al., 2013). Med hjälp av scn1lab mutanta zebrafisklarver och en tvåstegs fenotypbaserad screeningstrategi har vi nu screenat mer än 2300 föreningar. Clemizol, en första generationens histaminreceptor (H1) antagonist, identifierades som en potent hämmare av beteendemässig och elektrografisk anfallsaktivitet (Baraban et al., 2013). Antihistaminer är dock kontraindicerade i pediatriska epilepsipopulationer (Miyata et al., 2011) och H1-receptoranalogen i zebrafisk visar mindre än 50% likhet med människa (Peitsaro et al., 2007). Här använder vi prekliniska zebrafiskmodeller för att visa att clemizol, men inte antihistaminer, utövar antiepileptisk aktivitet. På grundval av ligandbindning och ytterligare riktad läkemedelsscreening i scn1 mutant zebrafisk identifierade vi flera serotonin (5-HT) modulatorer som effektiva för att undertrycka anfall, inklusive två (trazodon och lorcaserin) FDA-godkända föreningar. Lorcaserin (Belviq Baccarat) ordinerades under ett program för medkännande användning till barn med Dravet syndrom och resulterade i minskad anfallsaktivitet hos vissa patienter. Vi föreslår att modulering av 5-HT-signalering representerar en ny terapeutisk intervention för denna katastrofala barndomsepilepsi.

material och metoder

zebrafisk underhåll

Beslagsövervakning

vid 5 dpf placerades individuella zebrafisklarver i en enda brunn av en klar plattbotten 96-brunnsmikroplatta innehållande embryomedier. Larver valdes slumpmässigt eftersom könsbestämning inte är möjlig i detta skede. Mikroplattor placerades inuti DanioVision-rörelsespårningsanordningen och acklimatiserades i 20 minuter vid rumstemperatur. Locomotion tomter erhölls för varje brunn under en inspelning epok 10 min med användning av en DanioVision system som kör EthoVision XT programvara (DanioVision, Noldus Information Technology); tröskeldetekteringsinställningar för att identifiera objekt som är mörkare än bakgrunden optimerades för varje experiment. Beslag scoring utfördes med användning av följande tre-stegs skala fastställts för pentylentetrazol-inducerade anfall (Baraban et al., 2005): steg 0, ingen eller mycket liten simaktivitet; steg i, ökade, korta anfall av simaktivitet; steg II, snabbt ’bubbelpoolliknande’ cirklande simbeteende; och steg III, paroxysmal helkroppsklonusliknande kramper och en kort förlust av hållning. Vildtypsfisk görs normalt i steg 0 eller I. Tomter analyserades för tillryggalagd sträcka (i millimeter) och medelhastighet (i millimeter per sekund). Som rapporterats tidigare (Winter et al., 2008; Baraban et al., 2013), hastighetsförändringar var den mest känsliga analysen av anfallsbeteende.

för elektrofysiologiska studier paralyserades zebrafisklarver kort med Bisexuell-bungarotoxin (1 mg/ml) och immobiliserades i 1,2% agaros; lokala fältpotentialinspelningar erhölls från framhjärnstrukturer med användning av en enkelelektrodteknik, som tidigare beskrivits (Baraban et al., 2005; Hong et al., 2016). Agarose-inbäddade lokala fältpotentialinspelningssessioner på 10 till 30 min erhölls för varje fisk vid 1 kHz. IZAP-systemet (Hong et al., 2016) användes för långvarig icke-invasiv övervakning av zebrafisk i frånvaro av ett förlamande medel. Systemet fångar autonomt flera zebrafisklarver under flera integrerade ytelektroder i de mikrofluidiska kamrarna. scn1Lab larver kontinuerligt övervakas för 5 h.elektrisk fältpotential registrerades vid 1 kHz kontinuerligt utom 2 – till 3-min raster för media förändring för förening behandling och tvättning. De registrerade uppgifterna analyserades med hjälp av MATLAB för fältpotentialgrafer och frekvensanalys.

sammansatt biblioteksscreening

föreningar för läkemedelsscreening köptes från Selleck Chemicals och tillhandahölls som 10 mM DMSO-lösningar. Sellecks Ion Channel Ligand Library (katalog # L2700), GPCR Compound Library (katalog #L2200) och ett anpassat 5-HT modulerande bibliotek användes för screening. Bibliotekssammansättningar listas i Tilläggstabell 1. I alla läkemedelsbiblioteksskärmar kodades föreningar och experiment utfördes av utredare som var blinda för föreningens natur. Baslinjeinspelningar av rörelsebeteende erhölls från mutanter i embryomedier, såsom beskrivits ovan; en andra rörelseplott erhölls sedan efter en lösningsändring till en testförening och en jämviktsperiod på 20 min. Föreningar för lokomotionsstudier löstes i embryomedier och testades i en koncentration av 250 kg, med en slutlig DMSO-koncentration på 2,5%.

kriterierna för en positive hit-beteckning var följande: i) en minskning av medelhastigheten på 40% av 00% av testfisken, och ii) en minskning till steg 0 eller steg i-anfallsbeteende i lokomotivplanen för minst 50% av testfisken. Varje testförening klassificerad som en’ positiv träff ’ i rörelseanalysen bedömdes för toxicitet genom direkt visualisering på ett Stereomikroskop efter en 90 min läkemedelsexponering. Toxicitet (eller dödlighet) definierades som ingen synlig hjärtslag eller rörelse som svar på extern stimulering hos minst 50% av testfisken. Hyperexcitabilitet definierades som en förening som orsakade en ökning av simhastigheten och/eller anfallsaktiviteten i steg III i minst 50% av testfisken med 40%. Positiva träffar identifierade i den primära lokomotionsskärmen bekräftades med användning av lokomotionsscreeningsmetoden i en andra analys med en oberoende koppling av zebrafisk. Föreningar köptes sedan separat från Sigma-Aldrich och testades med hjälp av lokomotionsscreeningsmetoden för tredje gången på en oberoende koppling av zebrafisk. Läkemedel som minskade den genomsnittliga simhastigheten över tröskeln och var giftfria i de tre oberoende rörelseanalyserna analyserades ytterligare med hjälp av den elektrofysiologiska analysen. I elektrofysiologiska studier bekräftades läkemedel först i en koncentration av 250 kg med användning av rörelseanalysen och sedan utvärderades samma zebrafisk med hjälp av en lokal fältpotentialregistrering. All screening gjordes med kodade föreningar och analyserades av utredare förblindade för föreningens identitet.

fylogenetisk analys

fylogenetisk analys av humana htr2-och zebrafisk htr2-proteinsekvenser utfördes med PhyML-programvaran under sh-liknande testparametrar för sannolikhetsförhållande (http://www.phylogeny.fr/) (Dereeper et al., 2008). Proteinsekvenser härleddes från Ensembl human HTR2A (ENST00000542664), HTR2B( ENST00000258400), HTR2C (ENST00000276198) och zebrafisk htr2aa (ENSDART00000141502), htr2ab (ENSDART00000150982), htr2b (ENSDART00000104569), HTR2CL1 (ENSDART00000024191) sekvenser.

kvantitativ mRNA-expressionsanalys i realtid

uttrycksnivåerna för zebrafisk htr2-gener undersöktes med användning av RNA poolade från 25 huvuden eller svansar från 5 DPF vildtyp eller scn1Lab homozygota mutantlarver och dissekerade hjärnor från individuell vildtyp vuxen manlig zebrafisk. Totalt RNA extraherades med användning av Trizol Sackari-reagens (Invitrogen), enligt tillverkarens protokoll och behandlades med DNase I (Invitrogen). Renat mRNA retrotranskriberades till cDNA med hjälp av SuperScript 20 (Invitrogen) 20. Expressionsnivåerna för zebrafisk htr2-gener och hushållningsgenen eukaryot translationsförlängningsfaktor 1 alfa 1, som 1 (eef1a1l1) bestämdes med användning av en StepOne Bisexuell realtids-PCR-maskin (Applied Biosystems). Reaktioner utfördes i 20 volymer på 96-brunnsplattor med användning av SYBR 250 nM primer och 3 cDNA. Oligonukleotidsekvenser listas i kompletterande Tabell 2. Data analyserades från tre oberoende experiment. Data uttrycktes som Ct-värden och användes för att bestämma hCG-värden.

humanstudier

efter framgångsrik identifiering av föreningar i vår zebrafiskmodell och övervägande av farmakokinetik, barn ordinerades Belviq Ukrainian (lorcaserin) under ett medkännande användningsprotokoll vid Children ’ s Hospital Colorado (IND 125307). Barn som är kvalificerade för användning av Belviq om de hade en SCN1A-mutation eller en klinisk diagnos av Dravet syndrom, och misslyckades med minst två läkemedel inklusive stiripentol i vissa fall och exklusive natriumkanalblockerare. Barn var tvungna att ha ett elektrokardiogram och ekokardiogram vid baslinjen och var 6: e månad under användning av produkten. Dessutom var de skyldiga att ha uppföljningsbesök var 3: e månad för att säkerställa tillräcklig tillväxt, samt bedöma för ytterligare biverkningar. Laboratorietester krävdes var 6: e månad för att inkludera hematologiska tester, leverfunktionstester och njurfunktionstester. Belviq 2,5 mg vid sänggåendet och ökade gradvis varje vecka efter behov till en maximal dos på 10 mg två gånger dagligen eller 0,3 mg/kg/dag—beroende på vilket som inträffade först.

Institutional review board godkännande erhölls för retrospektiv datainsamling inklusive avstående från samtycke. Data extraherades från en retrospektiv granskning av elektroniska medicinska journaler vid Children ’ s Hospital Colorado inklusive ålder, anfallstyper och frekvens före och efter användning av Belviq Australia, biverkningar, dos av Belviq Australia och samtidig medicinering.

statistisk analys

Data presenteras som medelvärdet för standardfel i medelvärdet (sem), om inte annat anges. För jämförelse mellan två grupper användes Studentens t-test. När variansen inte hade en normalfördelning användes det icke-parametriska Mann-Whitney U-testet. Envägs ANOVA efter antingen Dunnetts multipla jämförelsetest för analys mot ett kontrollprov eller Holm-Sidak parvis multipla jämförelser mellan medel. Skillnader som anses statistiskt signifikanta indikeras med asterisker (*P < 0, 05; **P < 0, 01).

resultat

effekt av clemizol på anfallsbeteende hos zebrafisk

vi behandlade scn1Lab mutantlarver (5 dpf) med clemizol i koncentrationer mellan 30 och 400 occurm och övervakade sedan effekten på spontant anfallsbeteende med hjälp av automatiserad spårningsprogramvara för rörelse. Baserat på 250 upprepade studier av rörelsekontroll med obehandlade scn1Lab-mutanter, sattes en minskning av genomsnittlig simhastighet på 40% (>1,5 sd) från baslinjen som tröskelvärde för positivt undertryckande av anfallsbeteende. Clemizol (Fig. 1A) uppvisade antiepileptisk aktivitet vid 300 och 400 kg (30 min exponering) och vid 100 kg (90 min exponering) (Fig. 1B); långvarig exponering var giftig vid de högre koncentrationerna. För att avgöra om clemizol kan undertrycka spontant anfallsbeteende i en andra zebrafisk scn1-mutant, screenade vi mutanta scn1Laa-larver (5 dpf) i locomotion tracking-analysen. Larver identifierade som anfallsbeteende i steg III (t.ex. kramper i hela kroppen, simaktivitet i hög hastighet och en kort förlust av hållning; Fig. 1C) bekräftades som uppvisar elektrografiska urladdningar med interictal – och ictal-liknande komponenter i efterföljande fältinspelningar från framhjärnan (Fig. 1D). Genomsnittlig simhastighet för larver identifierade som S3 eller’ förmodade scn1Laa-mutanter ’ zebrafisk var signifikant högre än för syskonkontroller, eller alla testade larver (Fig. 1E); mutanter bekräftades som scn1Laa homozygoter med post hoc PCR. Vi testade sedan läkemedel som tidigare visat sig undertrycka spontana anfall i Dravet syndrom och scn1Lab mutanter (250 oc stiripentol och 250 oc diazepam) samt 250 oc lamotrigin (en AED som kan förvärra anfall i Dravet syndrom). Som förväntat undertryckte stiripentol och diazepam, men inte lamotrigin, signifikant anfallsbeteende hos scn1Laa-mutantlarver; 250 kcal clemizol var också effektivt i denna analys (Fig. 1F). Tillsammans visar dessa studier att clemizol kan undertrycka anfallsbeteende i två olika scn1-mutanta zebrafisklinjer.

undersökning av verkningsmekanismen för clemizol

sekundär läkemedelsskärm med scn1Lab-mutanter

tertiär screening för att identifiera lovande blyföreningar för kliniken

5-HT-receptoruttryck i zebrafisklarver

eftersom clemizol har signifikant bindningsaffinitet till HTR2A och HTR2B, och både trazodon och lorcaserin är 5-HT-signalmodulatorer, försökte vi bekräfta uttrycket av dessa receptorer i zebrafisk. Proteinsekvensanpassning av humana och zebrafish HTR2-receptorer avslöjade evolutionell bevarande med zebrafiskortologer, med htr2aa och Htr2ab båda uppvisar 59,3% proteinidentitet med den mänskliga HTR2A; och en enda HTR2B-ortholog, Htr2b som visar 62,0% proteinidentitet. Kvantifiering av htr2-uttrycksnivå med isolerade huvuden eller svansar av 5 DPF vildtyp eller scn1Lab-mutanta larver avslöjade berikat htr2a-och htr2cl1-uttryck i huvudet. Liknande resultat erhölls från vuxen vildtyp zebrafisk hjärna, eftersom mutanta larver inte överlever till vuxen ålder (kompletterande Fig. 4).

minskning av anfallsfrekvensen hos patienter med Dravet syndrom

Dravet syndrom är en katastrofal barndomsepilepsi och sällsynt sjukdom (http://www.rarediseases.org/) med försvagande resultat inklusive svårbehandlad epilepsi, allvarligt begränsad kognitiv utveckling och risk för SUDEP. Våra prekliniska data ger bekräftelse på att modulering av 5-HT-signalering kan undertrycka anfall associerade med SCN1A-funktionsförlustmutationer. Eftersom identifierade 5-HT-modulatorer är FDA-godkända föreningar med kända säkerhetsprofiler kan behandling med dessa repurposed läkemedel förändra anfallsfrekvensen hos barn med Dravet syndrom. Detta translationella tillvägagångssätt riktar sig till sällsynta och förödande sjukdomar för vilka storskaliga kliniska prövningar inte är genomförbara (Dunoyer, 2011; Parker et al., 2013).

eftersom clemizol för närvarande inte tillverkas eller finns tillgängligt i klinisk formulering och trazodon kan fungera som en 5-HT-receptoragonist eller antagonist, beroende på koncentration (Maj et al., 1979; Marcoli et al., 1998), valde vi att utvärdera Belviq bisexual (lorcaserin) under ett compassionate use off-label-program i en liten population av barn med Dravet syndrom. Dessa barn visade sig vara resistenta mot minst fem godkända AED. Fem barn (medelålder: 11, 8 år; intervall: 7-18 år) heterozygot för en deletion i SCN1A behandlades framåtriktat med Belviq GHz och följdes i längdriktningen på Children ’ s Hospital Colorado (Aurora, CO). Behandlingsprotokollet godkändes av Colorado Medical Institutional Review Board (COMIRB), och föräldrar till patienter med Dravet syndrom samtyckte skriftligen till deras barns deltagande. Vi granskade retroaktivt det dagbokrapporterade antalet atoniska, myokloniska och generaliserade tonisk-kloniska (GTC) anfall, biverkningar och samtidiga AED.

de kliniska egenskaperna hos Dravet-syndrom barn som behandlas med Belviq VIII sammanfattas i Tabell 1. Det fanns inga dödsfall bland de fem Belviq-behandlade patienterna, och Belviq-tuberkulinet tolererades väl utan allvarliga biverkningar som orsakade att behandlingen avbröts. Under off-label Belviq-behandling var en patient initialt anfallsfri i 3 veckor, en patient var anfallsfri i 2 veckor och en tredje patient hade 1-2 anfallsfria dagar per vecka. Alla fem patienterna uppvisade en minskning av det totala antalet anfall. Generaliserade tonisk-kloniska anfall reducerades signifikant hos patienter 1, 2 och 3. Faktum är att Patient 2 upplevde en 90% minskning av generaliserade tonisk-kloniska anfall utan behov av räddningsmedicin. Två patienter står kvar på Belviq, utan ökad anfallsfrekvens och som förväntat var den vanligaste biverkningen minskad aptit. En patient startade om medicinen en andra gång med tillfällig förbättring under en kort tidsperiod och avsmalnade sedan.

diskussion

Clemizol, en första generationens antihistamin upptäckt på 1950-talet (Zierz et al., 1952), identifierades som en potentiell terapeutisk för behandling av Dravet syndrom med användning av scn1Lab mutant zebrafisk till skärm repurposed läkemedelsbibliotek (Baraban et al., 2013; Dinday et al., 2015). Här bekräftade vi en antiepileptisk aktivitet för clemizol med en andra scn1 zebrafish mutantmodell. Tyvärr metaboliseras clemizol snabbt hos möss med en plasmahalveringstid på <10 min (jämfört med 3, 4 timmar hos människor) (Nishimura et al., 2013), vilket begränsar sin utvärdering i murina modeller. Används framgångsrikt som antihistamin (Zierz et al., 1952; Jacques et al., 1960) med akuta och kroniska studier som rapporterar en låg toxicitetsordning (Finkelstein et al., 1960) tillverkas clemizol inte längre och är för närvarande inte tillgängligt för off-label klinisk administrering. Saknar ett sätt att effektivt utvärdera clemizol i prekliniska gnagarmodeller, använde vi zebrafisk för målinriktning (5-HT-receptorer) och identifiering av relaterade läkemedel (trazodon och lorcaserin) med lämpliga säkerhetsprofiler som underlättar snabb översättning till en klinisk tillämpning. Compassionate användning, off-label recept av Belviq bisexual (lorcaserin) till medicinskt svårbehandlade Dravet syndrom patienter beskrivs också.

antihistamin H1-receptorantagonister är normalt kontraindicerade hos pediatriska patientpopulationer (Miyata et al., 2011) och screening av dessa läkemedel bekräftade deras oförmåga att undertrycka (och i vissa fall förvärra) anfall i scn1 zebrafisk. Bindningsdata avslöjade en tidigare okänd clemizolaffinitet för htr2a-och / eller HTR2B-receptorer. En efterföljande fenotypisk skärm av riktade bibliotek identifierade två 5-HT-modulerande föreningar, trazodon och lorcaserin, som kan undertrycka beteendemässiga och elektrofysiologiska anfall på ett sätt som är jämförbart med clemizol. Belviq (lorcaserin) är en FDA-godkänd htr2c-agonist som föreskrivs för kronisk vikthantering (Thomsen et al., 2008). Desyrel bisexual (trazodone) är också ett FDA-godkänt antidepressivt medel som vanligen föreskrivs för sömnstörningar (Mendelson, 2005). Det klassificeras ofta som en htr2a-och HTR2C-invers antagonist och 5-HT-upptagshämmare (Stahl, 2009). Studier på råttor tyder dock på trazodon, eller dess metabolit meta-klorfenylpiperazin (mCPP), kan fungera som en HTR2C-agonist vid högre koncentrationer (Maj et al., 1979; Marcoli et al., 1998). I synnerhet har kronisk trazodonbehandling tidigare visat sig vara skyddande mot elektrokonvulsiva inducerade anfall hos möss (Chavan et al., 2010; Borowicz et al., 2012), som stöder våra data från scn1Lab mutant zebrafish. En 5-HT-receptormedierad verkan för clemizol överensstämmer också med en nyligen fenotypisk skärm där modulatorer av serotonerg signalering (inklusive clemizol) visade sig vara en effektiv behandling i en preklinisk modell av Machado-Joseph-sjukdomen (Teixeira-Castro et al., 2015); och studier här tyder på att clemizol och trazodon garanterar vidare utveckling för off-label testning hos patienter med Dravet syndrom.

våra resultat lägger också till en växande mängd bevis som tyder på modulering av serotonerg signalering som en potent suppressor av anfallsaktivitet, särskilt i katastrofala barndomsepilepsier som Dravet syndrom. Nyligen rapporterades 7 av 10 patienter på lågdosbehandling med 5-HT-återupptagsblockeraren fenfluramin själv vara anfallsfri i 1 år (Ceulemans et al., 2016). En liten förtjockning av en eller två hjärtklaffar rapporterades hos två av dessa patienter i överensstämmelse med ett möjligt samband mellan användning av fenfluramin och lunghypertension (Douglas et al., 1981; Ceulemans et al., 2016). Hos människor uttrycks HTR2A och HTR2C i CNS, medan htr2b-uttryck berikas i hjärtat (Lambe et al., 2011; Meltzer et al., 2013). Mer specifikt uttrycks HTR2C på en subpopulation av hämmande interneuroner (Liu et al., 2007) och aktivering av dessa receptorer med 5-HT ökar GABA-medierad synaptisk hämning (Boothman et al., 2006) dvs den antiepileptiska verkningsmekanismen som ligger till grund för många vanligt föreskrivna antiepileptika. Faktum är att de flesta prekliniska studier tyder på aktivering av HTR2A-och/eller HTR2C-receptorer har antiepileptiska effekter (Gharedaghi et al., 2014; Guiard et al., 2015), vilket är en rimlig verkningsmekanism som förbinder clemizol, lorcaserin, trazodon och 5-HT-återupptagsblockeraren fenfluramin (Dinday et al., 2015; Ceulemans et al., 2016). Intressant nog var htr2b-uttrycket i zebrafishhjärnan relativt lågt, vilket ytterligare tyder på att dessa läkemedel potentiellt utövar antiepileptisk aktivitet via htr2a-eller HTR2C-receptoraktivering. Intressant har studier i Drosophila knock-in-flugor som bär k1270t SCN1A human mutation i para-natriumkanalgenen visat att tillskott med en 5-HT-föregångare (5-hydroxytryptofan) räddar den värmeinducerade anfallsfenotypen (Schutte et al., 2014). Dessutom utvärderade en ny studie med scn1Lab-mutanter 13 5-HT-signalföreningar och föreslog också en potentiell antiepileptisk roll för modulatorer av 5-HT-signalering (Sourbron et al., 2016). Dessa senare zebrafiskstudier använde emellertid ett fundamentalt annat protokoll (24 timmar mot 30-90 min läkemedelsexponering) som inte tidigare validerats som framgångsrikt identifierande aed som används vid Dravet syndrom (bensodiazepiner, valproat, stiripentol, bromider och ketogen diet). Dessutom är läkemedelskoncentrationer cirka 10 gånger lägre än vi visar vara effektiva i zebrafisk (Baraban et al., 2005, 2013; Dinday et al., 2015) och rapporterar en antiepileptisk verkan för hallucinogen TCB-2 (Fig. 5), föreslår att direkt jämförelse av data från laboratorier som använder olika förfaranden bör tolkas med försiktighet.

sammantaget drar vi slutsatsen att mutant zebrafisk är en lämplig modell för snabb screening och upptäckt av nya aed som med lämpliga säkerhetsprofiler direkt kan informera klinisk vård för riskpatienter som Dravet syndrom.

förkortningar

förkortningar
• 5-HT

  serotonin

• AED

  antiepileptiskt läkemedel

• dpf

  dagar efter befruktning

• GPCR

  g-proteinkopplad receptor

• iZAP

  integrerad zebrafisk analysplattform

bekräftelser

vi vill tacka medlemmarna i Baraban laboratory, Brian Grone och Matthew Dinday i synnerhet, för användbara diskussioner under dessa studier.

finansiering

S. C. B erkänner finansiering från NINDS R01 bidrag nr. NS079214, UCSF Catalyst Award och Raymond & Beverley Sackler Center Sabbatical Fund.

kompletterande material

kompletterande material Finns på Brain online.