CK20 och CK5 / 6 immunohistokemisk färgning av Uroteliala neoplasmer: ett perspektiv

Abstrakt

Cytokeratiner tillhör familjen mellanfilament. De uttrycks på ett mycket specifikt sätt i epitelceller där de spelar en avgörande roll för cellernas integritet och mekaniska stabilitet. Flera typer av cytokeratiner har beskrivits i såväl normalt som neoplastiskt urotel. I fallet med uroteliala neoplasmer har uttryck av CK20 och CK5/6 visats i flera studier ha diagnostiska och prognostiska konsekvenser. Således manifesterar låggradigt urotelialt karcinom CK-uttryck begränsat till paraplycellerna, medan höggradiga tumörer vanligtvis har ett uttryck i hela tjockleken på urotelet med undantag för basalskiktet. CK5 / 6-uttryck å andra sidan uttrycks i bascellerna i alla lågkvalitativa och vissa högkvalitativa uroteliala karcinom. Diffus CK20-färgning åtföljd av förlust av CK5/6-positivt baslager är vanligtvis förknippat med aggressivt kliniskt beteende. Dubbel färgning av bilderna för dessa cytokeratiner kan underlätta korrekt tolkning och korrelation.

1. Introduktion

Cytokeratiner tillhör familjen 10 nm mellanliggande filamentcytoskelett närvarande i alla celler. Mellanliggande filamentproteiner uttrycks på ett mycket celltypspecifikt sätt, och här representerar keratiner den typiska mellanliggande filamentkategorin närvarande i epitelceller. Dessa filament är en komplex grupp av vattenolösliga polypeptider, som sträcker sig i storlek från 40 000 till 68 000 Mr. I epitel kan keratinfilament buntas som tonofilament, fläta kärnan, spänna genom cytoplasman och fästa vid cytoplasmatiska plack av de typiska epitelcell-cellkorsningar, desmosomerna. Således spelar keratiner en viktig funktionell roll i integriteten och mekanisk stabilitet hos både de enskilda epitelcellerna och epitelvävnaderna och är en inneboende del av kontinuumet av stabilitet från singelcellen till vävnadsbildningen .

keratinproteinerna kan delas in i små sura typ i och stora basiska till neutrala typ II keratiner. En unik egenskap hos keratinerna är att de, i motsats till de andra mellanliggande filamentproteinerna, endast kan utgöra sitt filamentösa stadium genom parbildning av typ i och typ II (1 : 1) molekyler. Bland mänskliga keratiner innefattar den senaste konsensusnomenklaturen typ i keratiner K9-K10, K12–K28 och K31–K40 och typ II keratiner K1–K8 och K71–K86. I det mänskliga genomet grupperas keratingenerna på två olika kromosomala ställen: kromosom 17q21.2 (typ i keratiner, utom K18) och kromosom 12q13.13 (typ II keratiner och K18). Man tror att de två cytokeratinunderfamiljerna uppstod genom genduplikation och efterföljande divergens av CK8 och CK18 .

varje typ av epitelcell uttrycker en karakteristisk kombination av två till tio cytokeratin-isotyper. Således kan normala epitelceller in vivo eller in vitro identifieras med avseende på deras cytokeratin-isotypprofil. De karakteristiska cytokeratinprofilerna för de olika normala epitelcellstyperna tenderar att behållas efter neoplastisk transformation och denna funktion kan utnyttjas vid tumördiagnos. Cytokeratinprofiler av epitelceller kan emellertid också återspegla funktionell differentiering snarare än ursprungsvävnad. Således uttrycker metaplastiska celler cytokeratinprofilegenskaper hos deras morfologi snarare än för deras normala motsvarighet .

2. Cytokeratinuttryck i Urotel under embryologisk utveckling

cytokeratinerna är den första mellanliggande filamenttypen som uppträder under embryogenes, och alla celler i något skede av fostrets utveckling är cytokeratinpositiva. De första cytokeratin-isotyperna som ska uttryckas är CK8 + CK18-paret. Under embryologisk epitelial-mesenkymal transformation förloras cytokeratinuttryck av vissa linjer av celler, vilka antingen förblir cytokeratinnegativa och utvecklas till bindväv eller senare uttrycker cytokeratiner av sekundär epitel . Embryologisk utveckling av urinblåsan är från cloaca, en hindgutstruktur, som är en vanlig kammare för gastrointestinalt och urinavfall. Under de 4: e–7: e utvecklingsveckorna delas cloaca av urorektal septum i två delar: bakre anorektal kanal och främre urogenital sinus. Den övre delen av den urogenitala sinusen bildar urinblåsan .

under den tidiga utvecklingen av urinblåsan förvandlas foderepitelet gradvis från enkelt endodermalt epitel till flerskiktat urotelialt foder. Som mönstret för endodermalt foder i GI-kanalen är det utvecklande uroteliala fodret initialt diffust positivt för CK20 i alla lager. Under efterföljande mognad av urotelet utvecklas ett basalskikt som kan demonstreras av CK5 och CK13 positivitet. Ytterligare mognad av urotel innebär förlust av CK20 i praktiskt taget alla lager utom paraplycellerna. Således verkar det finnas tre distinkta faser av urotelial utveckling. Det första steget kännetecknas av brist på basala celler och CK20-uttryck i alla lager. Den andra fasen bestäms av basalskiktets utseende, men CK20-uttrycksmönstret är fortfarande diffust. I det tredje och sista steget finns mognad av CK20-uttrycksmönstret som kännetecknas av CK20 endast i paraplyskiktet. Basalskiktet är välutvecklat och kan demonstreras med CK5/6 eller CK13 immunfärgning .

3. Cytokeratinuttryck i normalt Urotel

urinblåsan är fodrad med urotel som är specialiserat för att fungera som en barriär mot urin och för att tillgodose förändringar i intraluminalvolymen. Urotelium framträder som ett flerskiktat epitel med tre cellzoner: (1) ett basalcellskikt bestående av celler i kontakt med och orienterat vinkelrätt mot källarmembranets plan; (2) den mellanliggande cellzonen bestående av 2-5 cellskikt; (3) ett luminalt eller ytligt cellskikt bestående av sena mellanliggande celler och stora, ofta binukleerade ”paraply” – celler med deras apikala yta vänd mot lumen. Paraplycellerna kännetecknas av en zonula occludens typ av cellkorsningar och genom närvaron av specialiserade plack av det asymmetriska enhetsmembranet i det apikala cellmembranet och inom intracellulära fusiforma vesiklar . Detta utseende beror på närvaron av riklig uroplakin i cellmembranet .

i det normala vuxna urotelet uttrycks CK7, CK8, CK18 och CK19 i alla uroteliala cellskikt, CK5 uttrycks basalt och CK20 är associerat med paraplyceller (Figur 1).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 1

(a) normalt urotel som avslöjar flera lager av celler inklusive basalcell, mellanliggande celler och paraplyceller. (b) immunhistokemisk fläck som avslöjar normalt färgningsmönster för urotelet. Paraplycellerna är dekorerade av CK20 (magenta). De mellanliggande cellerna är ofärgade. Basalceller är dekorerade med CK5 / 6-färgning (brun).

det kan också finnas några CK20-positiva celler i det mellanliggande cellskiktet i vissa normala prover .

4. Cytokeratinuttryck i papillär urotelial neoplasi

neoplastisk transformation av uroteliala celler ger upphov till urotelial karcinom, den vanligaste formen av blåscancer i de flesta länder. Många patienter har ytliga tumörer som antingen är icke-invasiva (pTa) eller invaderar endast lamina propria (pT1). Även om återfall är vanligt (50-70%), kan sjukdomen vanligtvis kontrolleras genom lokal behandling. Ändå utvecklas 10-15% av patienterna med ytlig sjukdom så småningom till muskelinvasiv och metastatisk sjukdom. En ökning av graden, kännetecknad av en förlust av differentiering, och närvaron av dysplastiska förändringar är båda determinanter för dålig prognos. Dessutom visar vissa uroteliala karcinom basal / skivepiteldifferentiering, vilket har associerats med sämre prognos .

det immunohistokemiska färgningsmönstret för cytokeratin20 och CK5/6 varierar med typen och naturen hos den uroteliala neoplasmen. Exempelvis avslöjar papillära uroteliala neoplasmer med begränsad malign potential (PUNLMP) såväl som lågkvalitativa papillära karcinom CK20 begränsad till paraplycellerna och CK5/6-färgning begränsad till basalskiktet, identiskt med fördelningen av dessa keratiner i det normala urotelet (Figur 2).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figur 2

(a) låggradigt papillärt urotelialt karcinom. (b) immunhistokemisk fläck som visar CK20-uttrycket (magenta) begränsat till paraplycellerna och ett välformat baslager som avbildas genom CK5/6-färgning (brun). (c) Låggradigt urotelialt karcinom med färgning av basala celler men saknar paraplyceller.

höggradiga uroteliala karcinom tenderar å andra sidan att ha diffus immunreaktivitet för CK20 som involverar paraplycellerna såväl som Mellanskiktet. Dessutom kan basalskiktet demonstreras med CK5 / 6 positivitet (Figur 3).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figur 3

(a) högkvalitativt papillärt urotelialt karcinom. (b) högkvalitativt papillärt urotelialt karcinom med diffus färgning i full tjocklek för CK20 och närvaro av basalskikt som demonstreras genom CK5/6-färgning. (c) höggradigt urotelialt karcinom som avslöjar den diffusa närvaron av basala celler och färgning i full tjocklek för CK20.

högre grad papillärt urotelialt karcinom avslöjar å andra sidan CK20-uttryck i hela uroteliets tjocklek med frånvaro av basalskikt och negativ färgning för CK5/6 (figur 4).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figur 4

(a) höggradigt urotelialt karcinom med partiell förlust av basala celler men diffus färgning för CK20. (b) högkvalitativt urotelialt karcinom med nästan fullständig förlust av basala celler. (c) högkvalitativt papillärt urotelialt karcinom som avslöjar diffus immunhistokemisk färgning för CK20 och fullständig frånvaro av basalskikt utan färgning för CK5/6.

detta mönster med diffus FULLTJOCKLEK CK20-färgning i frånvaro av basalskiktfärgning är också en funktion som påträffas i högkvalitativa uroteliala karcinom med lamina propria eller muskelinvasion (Figur 5).

(a)

(b)

(a)
(b)

Figur 5

(a) höggradigt urotelialt karcinom med tidig invasion som visar stark CK20 cytoplasmatisk färgning och frånvaro av basala celler. (b) högkvalitativt urotelialt karcinom med omfattande invasion. Karcinomcellerna är diffust positiva för CK20, men basalskiktet är frånvarande.

det har föreslagits att mönstret för CK20-färgning är ett användbart komplement till morfologi vid diagnos av urotelial karcinom. Det har också föreslagits att CK20-uttryck kan förutsäga malign potential i lågkvalitativa uroteliala tumörer, och därför kan CK20 vara användbart för att definiera behandlingsstrategier för patienter med dessa tumörer. CK20-uttryck behölls av de flesta av de rena uroteliala karcinomerna, vilket behöll det normala ytliga lokaliseringsmönstret i vissa väl differentierade papillära tumörer eller visade en heterogen eller likformigt positiv reaktion genom alla cellskikt. Delar av karcinom med skivepiteldifferentiering avslöjar en minskning av CK20-uttrycket. Dessa områden reagerar dock positivt för CK5 / 6(figurerna 6(A) och 6 (b)) i ett mönster som skiljer sig från basalskiktets basala fördelning .

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figur 6

(a) högkvalitativt urotelialt karcinom med fokal skivepiteldifferentiering. (b) immunhistokemisk färgning som visar stark CK5/6-färgning i området för skivepiteldifferentiering. Den återstående delen av karcinomfläckar för CK20. (c) högkvalitativt urotelialt karcinom med basosquamous morfologiska egenskaper. (d) immunhistokemisk färgning i basosquamous karcinom med stark immunfärgning för CK5/6 och fullständig frånvaro av CK20-positivitet.

i vissa fall kan hela karcinomet visa basosquamous egenskaper. Dessa fall visar stark reaktivitet för CK5 / 6 med liten eller ingen positivitet för CK20 (figurerna 6(c) och 6(d)).

två nyligen publicerade studier har gett ytterligare bevis för den kliniska betydelsen av olika immunfärgning för CK20 och CK5/6. I en av dessa studier analyserades tumörprover från 222 patienter med uroteliala karcinom i övre tarmkanalen som behandlades med radikal nefroureterektomi för uttryck av sju basala/luminala immunhistokemiska markörer (CK5, EGFR, CD44, CK20, p63, GATA3 och FOXA). Genom att använda CK5 och CK20 definierade de fyra subtyper av uroteliala karcinom i övre tarmkanalen:(i)exklusivt CK20−positivt och CK5−negativt (CK20+/CK5−) (ii)exklusivt CK5−positivt och CK20− negativt (CK20-/CK5+)(iii)båda markörerna positiva (CK20+/CK5+)(iv)båda markörerna negativa (CK20-/CK5 -)

i multivariat Cox regressionsanalys var CK20+/CK5-subtypen en oberoende negativ prognostisk markör med en 3,83-faldig ökad risk för CANCERSPECIFIK död jämfört med de andra tre subtyperna .

i en andra studie rapporterades immunhistokemisk färgning för CK5/6 och CK20 vara korrelerad med prognosen för tidigt urotelialt karcinom. Dessutom har genuttrycksprofilerna för undergrupper av icke-muskelinvasiv papillär höggradig urotelial karcinom i övre tarmkanalen (UTUC) klassificerad av CK5/6-och CK20-uttrycksnivåer studerades och korrelerades med kliniska resultat. Dessa undergrupper inkluderade CK5/6-hög/CK20-låg, CK5/6-hög/CK20-hög och CK5/6-låg / CK20-hög. Den senare gruppen kännetecknad av lågt uttryck av CK5/6 och högt uttryck av CK20 var prediktiv för sämre prognos för icke-muskelinvasiva papillära höggradiga uroteliala karcinom. Transkriptionsanalys avslöjade 308 differentiellt uttryckta gener över undergrupperna. Funktionella analyser av generna identifierade celladhesion som en vanlig process differentiellt berikad i denna undergrupp jämfört med de andra, vilket kan förklara dess högriskfenotyp. Sen cellcykel/proliferation signaturer berikades också i denna undergrupp . Således verkar det som om uroteliala tumörer som kännetecknas av diffus färgning för CK20 i frånvaro av påvisbart basalskikt representerar den mest aggressiva subtypen av papillär urotelial karcinom.

Cytokeratin 5/6 finns i den normala keratiniserande epidermis och skivepitel i slemhinnan, liksom i basala celler eller myoepitelceller i bröstet, spottkörtlarna och prostata . I prostata-och bröstbiopsier dekorerar CK5/6 basalcellskiktet och är således användbart vid diagnos av invasivt karcinom, varvid det senare saknar basala celler. Uroteliets arkitektur skiljer sig från det prostata-eller bröstkanalepitelet med resultatet att närvaron eller frånvaron av basala celler inte kan användas för att stratifiera uroteliala neoplasmer till godartade eller maligna typer. Frånvaron av basala celler i uroteliala neoplasmer kan emellertid indikera dålig prognos. Således kan ett högkvalitativt urotelialt karcinom med ett bevarat basalskikt uppträda mindre aggressivt jämfört med en annan höggradig tumör där basalskiktet har gått förlorat. I vårt laboratorium använder vi dubbelfärgning för dessa cytokeratiner vilket är extremt användbart vid korrekt tolkning av dessa fläckar.

ett liknande färgningsmönster kan också ses i urotelialt karcinom in situ . Dessa lesioner är vanligtvis starkt reaktiva för CK20 och kan eller inte behålla det CK5/6-positiva basalcellskiktet. Clinging typ av urotelial karcinom in situ och pagetoid förlängning av karcinomceller kan också kännas igen genom positiv CK20-färgning (Figur 7).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figur 7

(a) Urotelialt karcinom in situ med stark immunfärgning i full tjocklek för CK20 med ett distinkt basalcellskikt positivt för CK5/6. (b) ett annat urotelialt karcinom in situ med stark färgning för CK20 och frånvaro av basalskikt. (c) Pagetoid förlängning av urotelial karcinom demonstrerad genom stark cytoplasmatisk färgning för CK20 i en bakgrund av flera lager av basala celler reaktiva för CK5/6.

i en minoritet av fallen kan karcinom in situ vara reaktivt för CK5 / 6 vilket indikerar en basaloid differentiering .

5. Embryologisk urotelial differentiering kontra dedifferentiering i urotelial neoplasi

den nära korrelationen mellan cytokeratin-isotyputtrycksmönster och epitelial differentiering antyder att cytokeratiner är avgörande för epitelvävnadsstruktur och/eller funktion. Det har emellertid varit svårt att fastställa vad de exakta bidragen från individer eller kombinationer av cytokeratin isotyper är till normal och neoplastisk epitelcellfenotyp och beteende. Således återspeglar förändringarna i CK20-immunolokalisering som indikerar en högre risk för återfall av urotelialt karcinom troligen en sekundär förändring relaterad till dysreglering av det uroteliala differentieringsprogrammet under karcinogenes snarare än att indikera att CK20 är direkt involverad. Det kan spekuleras att uttrycksmönstren för CK20 och CK5/6 i olika uroteliala karcinom tenderar att efterlikna stadierna av embryologisk utveckling och differentiering av urotelium. Således kan högkvalitativa uroteliala karcinom (med eller utan invasion) som kännetecknas av diffust CK20-uttryck utan något basalskikt representera det tidiga stadiet av urotelial differentiering efter att urogenital sinus separerats från cloaca . Under detta utvecklingsstadium manifesterar urotel diffus CK20-färgning men saknar ett basalt lager. I några av de högkvalitativa uroteliala karcinomerna finns det enhetlig färgning av alla lager med CK20, men det finns också ett välformat baslager som kan påvisas genom uttryck av CK5/6. Detta kan motsvara mellanstadiet av embryonal urotelial differentiering. De väl differentierade uroteliala karcinomerna kännetecknas av närvaron av ett moget mönster av CK20-uttryck där dess uttryck för det mesta är begränsat till paraplycellerna, medan väldefinierat basalcellskikt immunoreaktivt för CK5/6 också är närvarande (figurerna 8 och 9).

figur 8

(a) tecknad film som visar stadier av differentiering under embryologisk utveckling av urotelet. Under de tidiga stadierna behåller det utvecklande urotelet CK20-uttryck som normalt ses i cloaca. Under detta stadium finns inget basalskikt närvarande. b) under utvecklingen av urotel kan det basala skiktet inte påvisas genom färgning för CK5/6. (C) slutstadiet av urotelial differentiering med normalt uttryck av CK20 begränsat till paraplycellerna och närvaron av normalt basalskikt som manifesterar uttryck av CK5/6.

Figur 9

(a) tecknad film som visar immunhistokemiskt färgningsmönster i ett lågkvalitativt papillärt urotelialt karcinom med CK20-uttryck begränsat till paraplycellerna och närvaron av ett väldefinierat baslager som uttrycker CK5/6. (B) höggradigt urotelialt karcinom avslöjar uttryck av CK20 i alla lager av urotelium utom för det basala skiktet som innehåller CK5/6. Detta kan representera ett mellanstadium av dedifferentiering av tumören. (c) i höggradigt urotelialt karcinom kan basskiktet vara frånvarande men det diffusa CK20-färgningsmönstret bibehålls. Dessa egenskaper kan indikera ytterligare dedifferentiering av karcinom.

detta mönster kan motsvara det sista steget av urotelial utveckling och mognad under intrauterin period.

Sammanfattningsvis kan immunhistokemisk färgning av urotelialt karcinom för CK20 och CK5/6 ge användbar information om arten av urotelialt karcinom och dess kliniska beteende.

datatillgänglighet

Inga data användes för att stödja denna studie.

intressekonflikter

författarna förklarar att de inte har någon finansiering eller intressekonflikter att avslöja.

bekräftelser

författarna vill erkänna värdefull hjälp och teknisk expertis hos följande övervakande och tekniska personal i vårt immunohistokemiska laboratorium i utförandet av den tvåfärgade immunohistokemiska färgningen: MS Rajaa Al Abdulla, handledare; MS Huda Ahmed Al Hijji, handledare; och Ms Zuhoor Ali, seniortekniker.