Cisplatin ototoxicitet involverar cytokiner och STAT6 signaleringsnätverk

reagenser

Cisplatin och 3-(4, 5-dimetyltiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) köptes från Sigma Chemical Co (Sigma, St Louis, MO, USA). Plastkulturmaterialen köptes från Becton Dickinson and Company (Franklin Lakes, NJ, USA). Dulbeccos modifierade essential medium( DMEM), fetalt bovint serum (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) och andra vävnadsodlingsreagenser erhölls från Life Technologies Inc. (Gaithersburg, MD, USA). Rekombinant mus IL – 4-och IL-13-protein, antikroppar mot IL-4, IL-13, TNF-sackarios, IL-1-sackarios, IL-6 och enzymbunden immunosorbentanalys (Elisa) Kit (QuantikineR) för cytokiner köptes från R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA). Dessa antikroppar användes för immunhistokemi i en koncentration av 1:200. Antikroppar mot p-STAT4, STAT4, p-STAT6, STAT6, NF-kB (p65) och IkB köptes från Santa Cruz Biotech Inc. (Santa Cruz, Kalifornien, USA).

cellkultur och livskraft

etableringen och karakteriseringen av de villkorligt odödliga hei-OC1-hörselcellerna beskrivs i vår tidigare rapport 1. Uttryck av OHC-specifika markörer som Math1 och Myosin 7a antyder att HEI-OC1-celler representerar OHC-prekursorer. Hei-OC1-celler bibehölls i DMEM med hög glukos (Gibco BRL) innehållande 10% FBS. För de experiment som beskrivs nedan odlades hei-OC1-celler under följande tillåtna betingelser: 33 kcal C och 5% CO2 i DMEM kompletterat med 10% FBS. Celler (3 104 104-celler/brunnsbrunn av en 24-brunnsplatin) inkuberades med 20 24 czcm cisplatin h. för att bestämma cellens livskraft tillsattes MTT (0,25 mg) till en 1 ml cellsuspension i 4 h. efter tvättning av cellerna och tre tvättar med PBS (pH 7,4) löstes den olösliga formazan-produkten i DMSO. Den optiska densiteten (OD) för varje kulturbrunn mättes sedan med användning av en Mikroplattläsare (Titertek Multiskan, Flödeslaboratorier) vid 590 nm. KONTROLLCELLERNAS OD togs för att indikera 100% lönsamhet. För att undersöka effekterna av olika cytokiner tillsattes neutraliserande antikroppar mot cytokiner till kulturerna i 30 minuter, varefter de odlades med 20 oC− C cisplatin i 24 timmar.

djur

STAT4−/− (backcross generation N10), STAT6−/ – (backcross generation N6) och WT BALB/c-möss köptes från Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). De homozygota STAT4-och STAT6 KO-mössen identifierades med PCR. KO-mössen visade inga utvecklingsavvikelser. Experiment utfördes i 6 veckor gamla Möss, och alla möss var åldersmatchade inom 3 dagar. Möss matades med en vanlig kommersiell diet medan de hölls vid en omgivningstemperatur på 20-22 kcal C och en relativ fuktighet på 50 kg 5% under en 12:12 h ljus:mörk cykel i en specifik patogenfri anläggning. Alla djurstudier godkändes av Animal Care and Use Committee vid Wonkwang University School of Medicine.

Luciferase reporter assay

celler transfekterades transient med NF-kB luciferase reporter plasmid med transfektionsreagens, Lipofektamin 2000. Efter 36 h inkubation behandlades cellerna med cisplatin under 12 h i närvaro av neutraliserande cytokinantikroppar. Cellerna tvättades sedan två gånger med PBS-buffert och lyserades därefter i reporter lysis buffer (Promega, Madison, WI, USA). En 20-occl alikvot av lysatet blandades sedan med 100 occl av luciferasanalysreagens, varefter den emitterade ljusintensiteten mättes med användning av en luminometer AutoLumat LB953 (t.ex. och G Berthold, Bad Wildbad, Tyskland). Slutligen mättes luciferasaktiviteten i triplikat, i genomsnitt och normaliserades sedan mot aktiviteten hos den s.k. bacill-galaktosidas med hjälp av analyssystemet galaktosidas (Galacto-Light, Tropix Inc., MA, USA) enligt tillverkarens instruktioner.

transfektion med siRNA-konstruktioner

förutbestämda sirna mot mus STAT4, STAT6 och kontroll kodade siRNA köptes från Santa Cruz Biotechnology. Sense-strängarna av siRNAs mot STAT4 och STAT6 är som följer. STAT4 siRNAs-konstruktionen är en pool av tre sekvenser av siRNA enligt följande: Duplex 1 Sense Strand: 5′-IndexTermGUA GCU GUG GUA AUU UCA a-3′, Duplex 2 Sense Strand: 5′-IndexTermCUA CCU UCC UGA UCU ACA a-3′ och Duplex 3 Sense Strand: 5′-IndexTermCUG UCG UGA UGA UUU CUA A-3′ (mRNA-anslutningsnummer: NM_011487). STAT6 siRNAs-konstruktionen är en pool av tre sekvenser av siRNA enligt följande: Duplex 1 Sense Strand: 5′-IndexTermGAU GCU UUC UGU UAC AAC a-3′, Duplex 2 Sense Strand: 5′-IndexTermCUA GCC UUC UCC UCA AUG a-3′ och Duplex 3 Sense Strand: 5′-IndexTermGUC UCU ACU ACU AUC AAG A-3′ (mRNA-anslutningsnummer: NM_009284). Celler transfekterades övergående med 100 nM siRNA-konstruktioner i X-tremeGENE siRNA transfektionsreagens (Roche Applied Science, Penzberg, Tyskland) enligt tillverkarens protokoll. Efter inkubation vid 33 C och 5% CO2 under 36 timmar behandlades cellerna ytterligare med cisplatin under 24 timmar. proverna bereddes sedan och analyserades för livskraft eller Western blot-analys. Interferensen av uttryck bekräftades genom immunoblot-analys.

mätning av proinflammatoriska cytokiner med ELISA

för att mäta utsöndringen av proinflammatoriska cytokiner från de cisplatinbehandlade cellerna skördades supernatanter för odling vid varje tidpunkt och nivåerna av utsöndrade proinflammatoriska cytokiner bestämdes sedan med ELISA (Quantikine Cytokine Kits; R& D Systems Inc.) enligt tillverkarens instruktioner.

beredning av cytosoliska och nukleära extrakt

celler tvättades med iskall PBS, skrapades och centrifugerades vid 1 000 kg i 5 minuter vid 4 kg C. cellpelleten resuspenderades sedan i 200 kg lysbuffert (10 mm HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid, och 0,5 mm ditiotreitol) och inkuberades sedan på IS i 15 minuter. Vid slutet av inkubationen tillsattes 10 occyl av 10% NP-40 och röret vortexerades i 10 s. Efter centrifugering vid 13 000 kg i 1 min vid 4 kg C uppsamlades supernatanten (cytosoliskt extrakt) och lagrades vid -80 kg C, medan pelleten bearbetades ytterligare för att erhålla kärnkraftsextrakten. Pelleten återsuspenderades sedan i extraktionsbuffert (5 mm HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 0,2 mm EDTA, 0,5 mM ditiotreitol och 25% (vol/vol) glycerol) och inkuberades i 30 minuter vid 4 kg C. nukleära extrakt isolerades genom centrifugering vid 13 000 kg g under 30 minuter vid 4 kg C. Supernatanten avlägsnades sedan och lagrades vid -80 2BG C tills den användes för western blot-analys. Slutligen bestämdes proteinkoncentrationen med Lowry-metoden.

Western blot-analys

Western blot-analys utfördes enligt följande. I korthet skördades cellerna och tvättades två gånger med iskall PBS. De totala och nukleära / cytosoliska fraktionerade lysaterna utsattes sedan för elektrofores på 12% SDS-polyakrylamidgeler för 3 h vid 20 mA, varefter de överfördes till nitrocellulosa. Membranet inkuberades sedan i 5% (wt/vol) torkat mjölkprotein i PBS innehållande 0,05% (vol/vol) Tween-20 (PBS-T) för 1 h, varefter de tvättades i PBS-t och reagerade sedan vidare med primär antikropp (1:1 000) för 1 h. därefter tvättades membranet i stor utsträckning med PBS-t och inkuberades sedan med anti-kanin IgG-antikropp konjugerad till HRP (1:3 000) för 1 h. efter omfattande tvättar, proteinband på membranet visualiserades med användning av kemiluminescerande reagens enligt tillverkarens instruktioner (supersignal substrat; Pierce, Rockford, IL, USA).

in vivo experiment av cisplatin ototoxicitet

alla möss delades slumpmässigt in i två grupper om sex möss vardera. Grupp 1-djur, som betraktades som en kontrollgrupp, fick intraperitoneal injektion av PBS. Grupp 2-djur administrerades cisplatin (4 mg/kg kroppsvikt) genom intraperitoneal injektion under 4 på varandra följande dagar. Djuren dödades sedan under anestesi med användning av CO2-gas dagen efter den slutliga cisplatininjektionen, varefter det temporala benet i höger öra avlägsnades.

mätning av ABR

för ytterligare analys av hörselgränsen mättes ABR före och 24 timmar efter den slutliga behandlingen av cisplatin. ABR-tröskelförändringarna mellan förbehandling och efterbehandling jämfördes sedan. Möss bedövades med en cocktail av ketamin (40 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) och hölls varma med en värmedyna under ABR-inspelning. En subdermal (aktiv) nålelektrod infördes vid vertexen, medan mark-och referenselektroder infördes subdermalt i den lösa huden under pinnae av motsatta öron. Teststimuli bestod av alternerande faston skurar vid frekvenser av 4, 8, 16 och 32 kHz. Signaler genererades med hjälp av Tucker Davis Technologies (TDT, Gainesville, FL, USA) Siggen programvara. Varje ton burst (1 ms varaktighet) var gated genom en Blackmann fönster, och hade en 0,5-ms rise-fall tid utan platå. Stimuli kalibrerades före varje testsession genom att spela in högtalarens utgång med en mikrofon placerad på djurens huvudnivå. ABR vågformer var i genomsnitt som svar på 300 ton skurar vid varje testad frekvens. Vid varje frekvens dämpades signalens amplitud automatiskt i steg om 10 dB från 90 dB SPL tills ABR-vågorna försvann i spår inspelade med filterinställningar på 100-3 000 Hz. Dom av tröskeln gjordes off-line av två oberoende, experimentellt blinda observatörer baserade på ABR register.

ytbehandling av Corti explants organ

alla möss dödades dagen efter den slutliga cisplatininjektionen. Det temporala benet dissekerades ut och fixerades i 4% paraformaldehyd för 16 h vid 4 CCB och sköljdes med 0,1 M PBS. Det temporala benet avkalkades ytterligare med 10% EDTA i PBS i 3 dagar. Snäckan dissekerades noggrant ut. Därefter dissekerades stria vascularis och spiralband bort och lämnade Cortis organ. Den mellersta svängen av cochlea nedsänktes i TRITC-märkt falloidin (Sigma P1951, 1:100) i PBS för 20 min. Efter tre tvättar med PBS undersöktes provet under ett fluorescensmikroskop med lämpliga filter för TRITC (excitation: 510-550 nm, emission: 590 nm).

immunohistokemisk färgning och TUNELANALYS

det borttagna temporala benet fixerades i 4% paraformaldehyd under 16 timmar och avkalkades sedan med 10% EDTA i PBS i 2 veckor, varefter det dehydratiserades och inbäddades i paraffinvax. Sektioner av 5 ACC deparaffiniserades i xylen och rehydratiserades genom graderade koncentrationer av etanol. För immunohistokemistudien användes ett immunohistokemi kit (DAKO LSAB Universal K680, Carpinteria, CA, USA) och procedurer utfördes enligt tillverkarens instruktioner. Det endogena peroxidaset blockerades sedan med 3% väteperoxid i 5 minuter vid rumstemperatur (RT). Efter att sektionerna tvättades i PBS blockerades icke-specifik bindning med 1% bovint serumalbumin i 1 h. primära antikroppar (1:200 utspädda) tillsattes sedan till glidbanorna, varefter inkubationen fortsatte i 1 h. efter upprepade tvättar med PBS inkuberades sektionerna med biotinylerad sekundär antikropp i 30 min och täcktes sedan i 30 min med en sekundär antikropp innehållande pepparrotperoxidas. Slutligen färgades sektionerna i en nyberedd substratlösning (3 mg 3-amino-9-etylkarbazol i 10 ml natriumacetatbuffert (pH 4,9), 500 TKG dimetylformamid, 0,03% väteperoxid) i 5 minuter. Kärnorna i de immunfärgade cellerna motverkades sedan med Mayers hematoxylin (Sigma-Aldrich Co.). Apoptotiska celler detekterades in situ med användning av TUNEL-analysen (TUNEL POD kit, Roche Molec Biochemic, Mannheim, Tyskland). Kortfattat deparaffiniserades och rehydrerades en sektion. Efter inkubation med 20 kg/ml proteinas K (Boehringer Mannheim, Mannheim, Tyskland) blockerades det endogena peroxidaset genom att inkubera proverna i 2% H2O2 i metanol i 30 minuter vid RT. därefter tvättades vävnadssektionerna i PBS och inkuberades med märkningslösning i 1 h vid 37 kg C. kärnorna motsattes sedan med propidiumjodid (0,5 kg/ml, molekylära prober) i 10 minuter vid RT. efter tvätt med PBS undersöktes provet under en period av fluorescensmikroskop.

omvänd transkriptas-PCR-amplifiering

för den cochleära PCR skördades det vänstra örat temporala benet snabbt och nedsänktes i RNAlater (Ambion, Inc., Austin, TX, USA) till användning vid -20 C. sedan dissekerades hela cochleae och användes för att extrahera totalt RNA genom användning av TRIzol (Invitrogen) enligt tillverkarens protokoll. Efter extraktion av det totala RNA med användning av Trizol (Invitrogen) syntetiserades enkelsträngad cDNA från det totala RNA. Därefter utfördes PCR med Taq-DNA-polymeras (Takara, Takara Shuzo, Japan) genom att utsätta proverna för 30 cykler av 95 C i 40 s, 58 C i 40 s och 72 C i 50 s. tio mikroliter av PCR-produkterna separerades sedan på 1,2% agarosgel och visualiserades under UV-ljus. Sekvenserna av primrarna som användes för PCR-amplifiering var följande: GAPDH (forward, 5′-IndexTermGGG TGT GAA CCA CGA GAA AT-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ATG AGC CCT TCC ACA AT-3′), TNF-α (forward, 5′-IndexTermCAG GGG CCA CCA CGC TCT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermCTT GGG GCA GGG GCT CTT GAC-3′), IL-1β (forward, 5′-IndexTermAAG GAG ACC AAG CAA CGA C-3′, reverse, 5′-IndexTermGAG ATT GAG CTG TCT GCT CA-3′), IL-2 (forward, 5′-IndexTermGTC AAC AGC GCA CCC ACT TCA AGC-3′, reverse, 5′-IndexTermGCT TGT TGA GAT GAT GCT TTG ACA-3′), IL-4 (forward, 5′-IndexTermACG GAG ATG GAT GTG CCA AAC GTC-3′, reverse, 5′-IndexTermCGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GC-3′), IL-5 (forward, 5′-IndexTermGCT CCT TCA GGA ATC TGT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGGC TCA TGTACT TTC ATG AG-3′), IL-6 (forward, 5′-IndexTermTTG CCT TCT TGG GAC TGA TGC-3′, reverse, 5′-IndexTermTTG GAA ATT GGG GTA GGA AGG A-3′), IL-10 (forward, 5′-IndexTermAGA CTT TCT TTC AAA CAA AGG ACC AGC TGG A-3′, reverse, 5′-IndexTermCCT GGA GTC CAG CAG ACT CAA TAC ACA CTG C-3′), IL-12 (forward, 5′-IndexTermACC TCA GTT TGG CCA GGG TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ACG ACG CGG GTG GTG AAG-3′), and IFN-γ (forward, 5′-IndexTermTAC TGC CAC GGC ACA GTC ATT GAA-3′, omvänd, 5 ’- IndexTermGCA GCG agera CCT TTT CCG CTT CCT-3’).

statistisk analys

varje experiment utfördes minst tre gånger, och alla rapporterade värden representerar medelvärdet av tredubbla analyser. Statistisk multivariat analys utfördes genom analys av varians och Duncan-test med hjälp av SPSS 11 (Chicago, IL, USA) statistisk programvara. Tvåvägs ANOVA och / eller envägs ANOVA användes för att bestämma betydelsen av resultaten. De statistiska resultaten granskades av en biostatistiker på masternivå. Värden för P < 0.05 ansågs vara statistiskt signifikanta.