Cirkulerande tumör-DNA

Pre-analytisk betraktningredigera

när blod samlas i EDTA-rör och lagras börjar de vita blodkropparna att lysa och släppa genomiskt vildtyps-DNA i provet i kvantiteter som vanligtvis är många gånger högre än ctDNA är närvarande i. Detta gör det svårare att upptäcka mutationer eller andra ctDNA-biomarkörer. Användningen av kommersiellt tillgängliga cellstabiliseringsrör kan förhindra eller fördröja lys av vita celler och därigenom minska utspädningseffekten av ctDNA. Sherwood et al demonstrerade överlägsen detektion av KRAS-mutationer i matchade prover samlade i både EDTA K3 och Streck BCT-rör. Fördelarna med cellstabiliseringsrör kan realiseras i situationer där blod inte kan bearbetas till plasma omedelbart.

andra procedurer kan också minska mängden” förorenande ” vildtyps-DNA och göra detektering av ctDNA mer genomförbart:

• frys aldrig ett blodprov innan du extraherar plasma för ctDNA-analys
• bearbeta provet till plasma inom 2-4 timmar (om det samlas i EDTA-rör)
• Använd aldrig hepariniserade rör, heparin hämmar PCR genom att efterlikna den spiralformade strukturen hos DNA
• utför ett dubbelcentrifugeringssteg (Centrifugera blodet för att ta bort plasma och upprepa sedan på plasma för att ta bort från skräp i rörets botten) för att ta bort mer cellulärt skräp före DNA-extraktion.
• Plasma är bättre än serum för ctDNA-återhämtning

extraktion av ctDNAEdit

huvudattraktionen för ctDNA-analys är att den extraheras på ett icke-invasivt sätt genom blodinsamling. Förvärv av cfDNA eller ctDNA kräver vanligtvis insamling av cirka 3 ml blod i EDTA-belagda rör. Användningen av EDTA är viktig för att minska koaguleringen av blod. Plasma-och serumfraktionerna av blod kan separeras genom ett centrifugeringssteg. ctDNA eller cfDNA kan därefter extraheras från dessa fraktioner. Även om serum tenderar att ha högre nivåer av cfDNA, tillskrivs detta främst DNA från lymfocyter. Höga nivåer av förorenande cfDNA är suboptimala eftersom detta kan minska känsligheten för ctDNA-detektering. Därför använder majoriteten av studierna plasma för ctDNA-isolering. Plasma bearbetas sedan igen genom centrifugering för att avlägsna kvarvarande intakta blodkroppar. Supernatanten används för DNA-extraktion, som kan utföras med kommersiellt tillgängliga kit.

analys av ctDNAEdit

analysen av ctDNA Efter extraktion kräver användning av olika amplifierings-och sekvenseringsmetoder. Dessa metoder kan delas in i två huvudgrupper baserat på om målet är att förhöra alla gener i ett oriktat tillvägagångssätt, eller om målet är att övervaka specifika gener och mutationer i ett målinriktat tillvägagångssätt.

oriktad approachedit

ett helt genom eller hela exome-sekvenseringsmetoder kan vara nödvändiga för att upptäcka nya mutationer i tumör-DNA under övervakning av sjukdomsbördan eller spårning av läkemedelsresistens. Oriktade tillvägagångssätt är också användbara i forskning för att observera tumör heterogenitet eller för att upptäcka nya läkemedelsmål. Men medan oriktade metoder kan vara nödvändiga i vissa applikationer, är det dyrare och har lägre upplösning. Detta gör det svårt att upptäcka sällsynta mutationer eller i situationer där låga ctDNA-nivåer är närvarande (såsom minimal kvarvarande sjukdom). Dessutom kan det finnas problem som skiljer mellan DNA från tumörceller och DNA från normala celler med hjälp av en hel genominriktning.

hela genomet eller exome-sekvensering använder vanligtvis DNA-sekvenseringstekniker med hög genomströmning. Att begränsa sekvenseringen till endast hela exomen kan istället minska kostnaden och öka hastigheten, men på bekostnad av att förlora information om mutationer i de icke-kodande regulatoriska regionerna i DNA. Medan man bara tittar på DNA-polymorfier genom sekvensering skiljer inte DNA från tumör eller normala celler, kan detta problem lösas genom att jämföra mot ett kontrollprov av normalt DNA (till exempel DNA erhållet genom en buccal swab.) Viktigt är att hela genomet och hela exome-sekvensering är användbara för initial mutationsupptäckt. Detta ger information för användning av mer känsliga riktade tekniker, som sedan kan användas för sjukdomsövervakningsändamål.

hela genomsekvensering gör det möjligt att återvinna de strukturella egenskaperna hos cfDNA, storleken på fragment och deras fragmenteringsmönster. Dessa unika mönster kan vara en viktig informationskälla för att förbättra detekteringen av ctDNA eller lokalisera vävnaden för ursprunget för dessa fragment. Storleksval av korta fragment (<150bp) med in vitro eller i silico-metoder kan förbättra återhämtningen av mutationer och kopianummeravvikelser.

Digital KaryotypingEdit

denna metod utvecklades ursprungligen av laboratoriet Bert Vogelstein, Luis Diaz och Victor Velculescu vid Johns Hopkins University. Till skillnad från normal karyotypning där ett färgämne används för att fläcka kromosomband för att visualisera kromosomerna, använder digital karyotypning DNA-sekvenser av loci genom hela genomet för att beräkna kopianummervariation. Kopianummervariationer är vanliga i cancer och beskriver situationer där förlust av heterozygositet hos en gen kan leda till minskad funktion på grund av lägre uttryck, eller duplicering av en gen, vilket leder till överuttryck.

Personlig analys av omarrangerade ändar (PARE)redigera

efter att hela genomet sekvenserats med hjälp av en sekvenseringsmetod med hög genomströmning, såsom Illumina HiSeq, tillämpas PARE på data för att analysera kromosomala omarrangemang och translokationer. Denna teknik var ursprungligen utformad för att analysera fast tumör-DNA men modifierades för ctDNA-applikationer.

DNA-metylering och Hydroximetyleringredigera

korrekt epigenetisk märkning är väsentlig för normalt genuttryck och cellfunktion och avvikande förändringar i epigenetiska mönster är ett kännetecken för cancer. En normal epigenetisk status upprätthålls i en cell åtminstone delvis genom DNA-metylering. Mätning av avvikande metyleringsmönster i ctDNA är möjligt på grund av stabil metylering av DNA-regioner som kallas ”CpG-öar”. Metylering av ctDNA kan detekteras genom bisulfitbehandling. Bisulfitbehandling omvandlar kemiskt ometylerade cytosiner till en uracil medan de lämnar metylerade cytosiner omodifierade. DNA sekvenseras därefter och eventuella förändringar i DNA-metyleringsmönstret kan identifieras. DNA-hydroximetylering är ett liknande associerat märke som har visat sig vara en prediktiv markör för friska kontra sjuka tillstånd i cfDNA, inklusive cancer. Mätning av avvikande hydroximetyleringsmönster i ctDNA har bevisats av forskare vid University of Chicago (Chuan He lab,) Stanford University (Quake lab,) och företaget Cambridge Epigenetix.

riktad approachedit

i ett riktat tillvägagångssätt kan sekvensering av ctDNA riktas mot en genetisk panel konstruerad baserat på mutationshotspots för cancer av intresse. Detta är särskilt viktigt för att informera behandling i situationer där mutationer identifieras i läkemedelbara mål. Att anpassa målinriktad analys av ctDNA till varje patient är också möjligt genom att kombinera flytande biopsier med standard primära vävnadsbiopsier. Hela genomet eller hela exomsekvensering av den primära tumörbiopsin möjliggör upptäckt av genetiska mutationer som är specifika för en patients tumör och kan användas för efterföljande målinriktad sekvensering av patientens ctDNA. Den högsta känsligheten för ctDNA-detektion uppnås genom målinriktad sekvensering av specifika singelnukleotidpolymorfismer (SNP). Vanligtvis muterade gener, såsom onkogener, som vanligtvis har hotspot-mutationer, är bra kandidater för riktade sekvenseringsmetoder. Omvänt har de flesta tumörsuppressorgener ett brett spektrum av möjlig förlust av funktionsmutationer i hela genen och är som sådana inte lämpliga för målinriktad sekvensering.

riktade tillvägagångssätt har fördelen att förstärka ctDNA genom polymeraskedjereaktioner (PCR) eller digital PCR. Detta är särskilt viktigt när man analyserar ctDNA inte bara för att det finns relativt låga nivåer av DNA som cirkulerar i blodomloppet, utan också för att ctDNA utgör en liten del av det totala cellfria DNA som extraheras. Därför kan förstärkning av regioner av intresse drastiskt förbättra känsligheten för ctDNA-detektion. Amplifiering genom PCR kan emellertid införa fel med tanke på den inneboende felfrekvensen för DNA-polymeraser. Fel som introduceras under sekvensering kan också minska känsligheten för att detektera ctDNA-mutationer.

Droplet Digital PCR (ddPCR)redigera

denna metod härrör från den digitala PCR, ursprungligen namngiven av Bert Vogelsteins grupp vid Johns Hopkins University. Droplet Digital PCR använder en droppgenerator för att partitionera enstaka bitar av DNA i droppar med hjälp av en olja/vattenemulsion. Därefter uppträder individuella polymeraskedjereaktioner i varje droppe med användning av utvalda primers mot regioner av ctDNA och fortsätter till slutpunkt. Närvaron av sekvenserna av intresse mäts av fluorescerande prober, vilka binder till den förstärkta regionen. ddPCR möjliggör mycket kvantitativ bedömning av allel-och mutantfrekvenser i ctDNA men begränsas av antalet fluorescerande sonder som kan användas i en analys (upp till 5). Analysens känslighet kan variera beroende på mängden DNA som analyseras och är cirka 1 av 10 000.

pärlor, emulgering, amplifiering och Magnetik (strålande)redigera

denna teknik bygger på dropp Digital PCR för att identifiera mutationer i ctDNA med hjälp av flödescytometri. Efter att ctDNA har extraherats från blod utförs PCR med primers utformade för att rikta sig mot de intressanta regionerna. Dessa primers innehåller också specifika DNA-sekvenser eller taggar. Det förstärkta DNA blandas med streptavidin-belagda magnetiska pärlor och emulgeras till droppar. Biotinylerade primers utformade för att binda till taggarna används för att förstärka DNA. Biotinylering tillåter det förstärkta DNA att binda till de magnetiska pärlorna, vilka är belagda med streptavidin. Efter att PCR är klar separeras de DNA-bundna pärlorna med hjälp av en magnet. DNA på pärlorna denatureras sedan och får hybridisera med fluorescerande oligonukleotider specifika för varje DNA-mall. De resulterande pärla-DNA-komplexen analyseras sedan med användning av flödescytometri. Denna teknik kan fånga allel-och mutationsfrekvenser på grund av koppling med ddPCR. Till skillnad från ddPCR kan emellertid ett större antal DNA-sekvenser förhöras på grund av flexibiliteten att använda fluorescerande bundna sonder. En annan fördel med detta system är att det isolerade DNA också kan användas för nedströms sekvensering. Känsligheten är 1,6 i 104 till 4,3 i 105.

CAncer personlig profilering genom djup sekvensering (CAPP-Seq)redigera

denna metod beskrevs ursprungligen av Ash Alizadeh och Maximilian Diehns grupper vid Stanford University. Denna teknik använder biotinylerade oligonukleotidväljarprober för att rikta sekvenser av DNA som är relevanta för ctDNA-detektion. Offentligt tillgängliga cancerdatabaser användes för att konstruera ett bibliotek av sonder mot återkommande mutationer i cancer genom att beräkna deras återfallsindex. Protokollet optimerades för de låga DNA-nivåerna som observerades i ctDNA-samling. Därefter genomgår det isolerade DNA djup sekvensering för ökad känslighet. Denna teknik möjliggör förhör av hundratals DNA-regioner. CtDNA-detektionskänsligheten för CAPP-Seq rapporteras vara 2,5 molekyler i 1 000 000.

taggad AMplicon deep Sequencing (TAM-Seq)redigera

TAM-Seq tillåter målinriktad sekvensering av hela gener för att detektera mutationer i ctDNA. Först utförs ett allmänt förstärkningssteg med primers som spänner över hela genen av intresse i 150-200bp-sektioner. Sedan används ett mikrofluidiksystem för att fästa adaptrar med en unik identifierare till varje amplicon för att ytterligare förstärka DNA i parallella singleplex-reaktioner. Denna teknik visade sig framgångsrikt identifiera mutationer spridda i TP53-tumörsuppressorgenen hos avancerade patienter med äggstockscancer. Känsligheten för denna teknik är 1 av 50.

Safe-Sequencing (Safe-Seq)redigera

denna metod beskrevs ursprungligen av Bert Vogelstein och hans grupp vid Johns Hopkins University. Safe-Seq minskar felfrekvensen för massivt parallell sekvensering för att öka känsligheten för sällsynta mutanter. Det uppnår detta genom tillsats av en unik identifierare (UID) sekvens till varje DNA-mall. DNA förstärks sedan med hjälp av de tillsatta uid: erna och sekvenseras. Alla DNA-molekyler med samma UID (en uid-familj) bör ha samma rapporterade DNA-sekvens eftersom de förstärktes från en molekyl. Mutationer kan emellertid introduceras genom amplifiering, eller felaktiga bastilldelningar kan kallas i sekvenserings-och analysstegen. Närvaron av UID gör att dessa metodfel kan separeras från sanna mutationer av ctDNA. En mutation anses vara en ’supermutant’ om 95% av de sekvenserade läsningarna är överens. Känsligheten för detta tillvägagångssätt är 9 i 1 miljon.

Duplex sequencingEdit

denna metod är en förbättring av de enskilda uid: erna som läggs till i Safe-Seq-tekniken. Vid duplexsekvensering fungerar randomiserat dubbelsträngat DNA som unika taggar och är fäst vid en invariant distans. Taggar är fäst båda ändarna av ett DNA-fragment (α och β-taggar), vilket resulterar i två unika mallar för PCR – en strand med en α tag på 5′ änden och en β tag på 3′ änden och den andra strängen med en β tag på 5′ änden och en α tag på 3′ änden. Dessa DNA-fragment förstärks sedan med primers mot de invarianta sekvenserna av taggarna. Det förstärkta DNA sekvenseras och analyseras. DNA med duplexadaptrarna jämförs och mutationer accepteras endast om det finns enighet mellan båda strängarna. Denna metod tar hänsyn till både fel från sekvensering och fel från tidigt stadium PCR-förstärkning. Känsligheten för tillvägagångssättet för att upptäcka mutanter är 1 i 10^7.

Integrated Digital Error Suppression (iDES)-enhanced CAPP-SeqEdit

iDES förbättrar CAPP-Seq analys av ctDNA för att minska fel och därmed öka känsligheten för detektering. Rapporterade i 2016, iDES kombinerar CAPP-Seq med duplex streckkodning sekvensering teknik och med en beräkningsalgoritm som tar bort stereotypa fel i samband med CAPP-Seq hybridisering steg. Metoden integrerar också duplexsekvensering där det är möjligt och inkluderar metoder för effektivare duplexåterställning från cellfritt DNA. Känsligheten för denna förbättrade version av CAPP-Seq är 4 i 100 000 exemplar.