Chp1-kromodomen binder h3k9me-svansen och nukleosomkärnan för att montera heterochromatin

plasmider och stammar konstruktion

Chp1CD-mutanter för uttryck och rening genererades genom invers PCR med användning av primrarna listade i kompletterande tabell S2 med början från pET28a CHP1 Kromodomainplasmid . Heterokromatinräddningsanalyser utfördes genom införande av plasmider innehållande chp1 wt och CHP1 mutantprotein under dess endogena promotor i en CHP1-stam (SP170, se kompletterande tabell S3) . CHP1 fullängdsgenen och dess endogena promotor (-949 bp från början av CHP1+ kodande sekvens) klonades i prep1-plasmiden. CHP1-kromodomainmutanter genererades genom invers PCR med användning av primrarna listade i kompletterande tabell S2 och transformerades i den angivna CHP1-stammen.

för genomisk integration modifierades prep1—plasmid för att ersätta nmt1+- promotorn med följande integrationskassett: (SphI) Region vid 5′ av CHP1—genen (kromosom i, 2215500-2215055) (AscI)—hphmx6-motståndskassett – (SphI) CHP1 endogen promotor (kromosom i, 2214829-2214664) – CHP1-kodande sekvens – (bamhi) CHP1 Terminator (kromosom i, 2210976-2210582) (bamhi). Integrationskassetten (både chp1 + och chp1loop1b / 2b-kassetten) förstärktes sedan PCR och transformerades genom elektroporation till SP101 -, SP170-och SP64-stammar. Celler valdes sedan på Yes + Hygromycin (50 mg ml−1 Hygromycin) plattor. Enstaka kolonier isolerades, PCR screenades och sekvenserades för den genomiska införandet av hphmx6-resistenskassetten och LOOP1B/2b-mutationerna.

stammar innehållande plasmider odlades på Edinburgh Minimal Medium Complete (EMMC)-leu media. Alla stammar och plasmider som används i denna studie listas i kompletterande tabeller S3 och S4.

proteinrening

His6-SUMO-Chp1CD och alla CD-mutanter uttrycktes i E. coli BL21 (de3) (pLys) och renas genom affinitetskromatografi genom användning av NI-nta-harts (GE Healthcare, Freiburg, Tyskland). His6-SUMO-Chp1CD innehåller trombinklyvningsplats mellan två taggar .

totalt tillsattes 0,2 mm IPTG för att inducera proteinuttryck följt av tillväxt vid 18 C o/N. celler skördades genom centrifugering och återupphängdes i lysbuffert (20 mm 4-(2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyra (HEPES) pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM ditiotreitol (DTT), 20 mM imidazol). Efter blixt frysning, celler tinades och inkuberades för 30 min i lysozym före ultraljudsbehandling (Branson Sonifier 250-utgång 4, arbetscykel 40). Suspensionen centrifugerades (12000 g, 20 min vid 4 kcal C) och supernatanten tillsattes till ni-nta-hartset förjämviktade i bindningsbuffert (20 mm HEPES pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, 20 mM imidazol) och inkuberades i 30 min vid 4 kg C under rotation. Resin tvättades sedan 5 kg med bindningsbuffert och proteiner eluerades i elueringsbuffert (20 mm HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 300 mM imidazol). Chp1CD wt och mutanter dyaliserades sedan O / N i en buffert innehållande 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT. His6-SUMO-Chp1CD renades sedan ytterligare genom gelfiltrering (Superdex 75 pg; GE Healthcare) och dialyserades i en buffert innehållande 20 mM HEPES pH 7.5, 75 mM KCl, 0.5 mM DTT.

Ljuddämpningsanalyser

celler för ljuddämpningsanalyser odlades till en OD 0,7–1 och normaliserades sedan till en slutlig koncentration av 1 107 celler ml−1 av odling. Tiofaldiga seriella utspädningar gjordes så att den högsta densitetspunkten innehöll 1 105-celler. Celler sågs på icke-selektiva (ja) och 5-fluoro-orotinsyra (5−FOA 1 g l-1 5-FOA) plattor. Plattorna inkuberades vid 32 kcal C i 2-3 dagar och avbildades. Celler har en ura4-reportergen införd i pericentromera imr-upprepningar (heterochromatic locus). När ura4 reporter gen tystas, celler kan växa på 5-FOA innehållande medium. När heterochromatin förloras uttrycks ura4-reportergenen och celler kan inte växa på 5-FOA-medium.

detektion av RNA-nivåer med qPCR (RT–qPCR)

jästkulturer (10 ml) odlades till en OD600 av 0,7-1,5. Cellerna återsuspenderades sedan i 500 oktyl lysbuffert (300 mM NaOAc pH 5,2, 1% natriumdodecylsulfat) och 500 oktyl fenol–kloroform och inkuberades vid 65 oktyl C under 10 min med konstant blandning. Den vattenhaltiga fraktionen separerades från fenol–kloroform genom centrifugering (10 min, 20 000 g) och etanol utfälldes. Nukleinsyror behandlades med DNAse I (Roche, Basel, Schweiz) för 30 min vid 37 C-C följt av 15 min vid 75 C-värmeinaktivering. Komplementärt DNA syntetiserades med användning av 100 ng RNA och 1 pmol DNA-oligos med Superscript III (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland) med användning av standardbetingelser. RNA-nivåer kvantifierades med qPCR genom att använda Biozym DyNAmo Flash qRT-PCR-kit och normaliserades till eukromatisk gen tdh1.

RNA elektroforetiska mobilitetsskiftanalyser

RNA-skiftanalys utfördes efter de tidigare rapporterade förhållandena . Totalt 0.66 pmoler av 32P radiomärkta 30 nt-centromeriskt RNA inkuberades med 10 occurm Chp1 kromodomain (vildtyp och mutant) i en buffert innehållande 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT och 3% Glycerol. För RNA EMSA med 100 nt GD centromera transkript inkuberades 2 pmoler av 32P radioaktivt märkt RNA med 0, 2 (1:1), 10 (1:5), 20 (1:10) pmoler av chp1cd-protein (wt och LOOP1B/2B mutant) i 15 occyl slutlig volym. H3k9me3 peptid (Eurogentec, K oc-Ln, Tyskland) tillsattes vid en 1:1 Chp1CD – H3K9me peptid, som rapporterats i . Inkubation utfördes för 1 h på is och prover (20 oC-l slutlig volym) laddades sedan på en 10% akrylamid-TBE-nativ gel (bis-akrylamid-förhållande 1:29). För in vitro-RNA-neddragningarna var 1 accug SUMO-Chp1CD (vildtyp och LOOP1B/2B mutant) bunden till 15 accusl Ni-nta-harts (GE Healthcare) och H3K9me3Nucleosome tillsattes för att montera Chp1CD-H3K9me3Nucleosome-komplexet i Bindningsbuffert (20 mM HEPES pH 7.5, 75 mM KCl, 0.5 mM DTT, 20 mM imidazol). Efter tvättning tre gånger med 50 oc bindningsbuffert tillsattes 2 pmoler av 32P-märkt 100NT DG RNA och inkuberades med Chp1CD-Nukleosomhartset på is under 1 h. hartset centrifugerades med långsam hastighet (60 g, 10 s) och genomflödet uppsamlades. Harts tvättades i tre gånger med minst 3 kg bindningsbuffert (v/v) och Chp1CD-nukleosom-RNA-komplexet eluerades genom tillsats av 300 mM imidazolbuffert (20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT, 300 mM imidazol), inkuberades i 1 h på is med 5 min intervallblandning (bunden fraktion). Proverna laddades på en 10% TBE-nativ Akrylamidgel (bis-akrylamid-förhållande 1:29) och kördes i 2 timmar vid 10 mA vid 4 kcal C. efter exponering över natten skannades geler med TyphoonFLA9000 fosfoimager.

Kromatinimmunutfällning

jästkulturer (100 ml) odlades till en OD600 på 0,7 och tvärbunden med 3% formaldehyd vid rumstemperatur under 15 min som beskrivet . Reaktionen släcktes med 125 mM glycin i 10 minuter vid rumstemperatur. Cellerna återsuspenderades i 500 ox-lysbuffert (50 mm HEPES pH 7,5, 1.5 m natriumacetat, 5 mM MgCl2, 2 mM etylendiamintetraättiksyra, 2 mM etylenglykoltetraättiksyra, 0,1% NP-40, 20% glycerol) innehållande proteashämmare (proteashämmare cocktailtabletter, Roche, komplett, etylendiamintetraättiksyrafri). Frysta celler lyserades med användning av MP Biospec pärlvisp. Efter Lys, extraktet sonicated 35 GHz för 30 s (Bioruptor, Diagenode, Seraing, Belgien) och spunnet på 13 000 g för 15 min för att erhålla kromatin supernatant. För inmatat DNA användes 50 Aci l av supernatanten. För immunutfällningar normaliserades supernatanterna baserat på proteinkoncentrationen och inkuberades med anti-dimetylerad h3k9-antikropp eller anti-Chp1-antikropp (H3K9me2, Abcam no. Ab1220 och Chp1, Abcam nr. Ab18191), immobiliserad på magnetiska Dynabeads, för 2 h vid 4 kg C. pärlorna och immobiliserat protein tvättades 5 kg med 1 ml lysbuffert. Proteiner eluerades genom inkubering med 150 oc elueringsbuffert (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM etylendiamintetraättiksyra, 1% natriumdodecylsulfat) vid 65 oc C i 15 min. Tvärbindningar vändes genom inkubation vid 65 C i natt följt av RNA-nedbrytning med RNAs A och proteinnedbrytning med Proteinas K. DNA utvanns sedan genom fenol–kloroformextraktion och etanolutfällning och kvantifierades med användning av qPCR. Eukromatisk gen tdh1 användes för normalisering. Oligonukleotider som används i kromatinimmunutfällningsanalyser listas i kompletterande tabell S2.

nukleosom in vitro-rekonstitution och (H3K9me3) metylering

nukleosomer rekonstituerades med användning av Xenopus laevis-histoner och 601-sekvensen som tidigare beskrivits . In vitro-metylering gjordes som beskrivet . Toppen vid + 42 Da har observerats i originalpublikationen och det är inte en förorening (Matt Simon, personlig kommunikation och beskrivs i ).

in vitro chp1cd–H3K9me3 MLA Nukleosomkomplexbildning och eluering

totalt binds 5 baccolg Chp1CD till 15 baccoll Ni-nta-harts i bindningsbuffert (20 mm HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT, 20 mM imidazol) under 20 min vid 4 baccol C. Hartset tvättades en gång med fem volymer bindningsbuffert och 10 occurg H3K9me3 metyllysinanalog (MLA) nukleosomer tillsattes (MLA-nukleosomer dialyserades tidigare i bindningsbuffert) i en slutlig volym av 20 occurl och inkuberades 1 h på is med konstant återupphängning var 5: e minut. Efter inkubation centrifugerades hartset (60 g i 10 s) och genomflödet uppsamlades. Hartset tvättades sedan tre gånger med fem volymer bindningsbuffert. SUMO-Chp1CD-H3K9me3Nucleosome-komplexet eluerades genom tillsats av trombin (Sigma, Munich, Tyskland) för 2 h på IS i 20 occyl bindningsbuffert. Komplex bildning bedömdes sedan genom SDS-polyakrylamidgelelektrofores på 15% akrylamidgeler och genom negativ fläck EM.

Chp1CD H3K9me3 peptidbindningsanalyser

totalt inkuberades 1 kg-Histon H3 (1-21)-GGK(Biotin) peptid (Eurogentec) med 15 kg streptavidin agarosharts (Invitrogen) i 20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT. Cirka 5 kg chp1cd (både wt och mutanter) tillsattes sedan i en slutlig volym på 20 kg och inkuberades i 1 timme på is under samma buffertbetingelser. Hartset tvättades tre gånger och sedan bedömdes bindningseffektiviteten på SDS-polyakrylamidgelelektrofores på 15% akrylamidgeler. Kvantifiering av bindning gjordes med hjälp av ImageJ-programvaran. Bindning av varje mutant normaliserades till wt Chp1CD för varje analys.

Microscale thermophoresis (MST)

för mst SUMO tag avlägsnades från Chp1CD-konstruktioner med Ulp1-proteas. Totalt märktes 100 USCG av vildtyp och mutant Chp1CD fluorescerande med användning av MO-L003 Monolith-Proteinmärkningssatsen BLUE-NHS (Aminreaktiv) enligt tillverkarens instruktioner (Nanotemper Technologies, Munich, Tyskland). En 1: 1 fluorescens: protein förhållande uppskattades genom att använda nanodrop1000 programvara ’proteiner och etiketter’ funktion och varje CHP1 Kromodomain kördes på en 15% SDS akrylamid gel för att normalisera koncentrationer till 0,1 mg ml−1.

reaktioner monterades i 20 occyl med 300 ng fluorescerande Chp1CD, och ökande mängder av-histon H3 (1-21)-GGK(Biotin) peptid (Eurogentec) eller H3k9me3nukleosomer, i en buffert innehållande 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 mM DTT och 0,05% Tween-20. För H3k9me3nukleosomer-bindande analyser glycerol tillsattes till 10% slutlig koncentration. För h3k9me3-analyser användes dessa utspädningar för mätningar: 0 nM, 9 nM, 13 nM, 20 nM, 31 nM, 46 nM, 70 nM, 105 nM, 158 nM, 237 nM, 355 nM, 530 megapixelm, 800 megapixelm, 1,2 megapixelm, 1,8 megapixelm. För h3k9me3nucleosome-analys använde vi följande utspädningar för mätningar: 0 nM, 18 nM, 27 nM, 41 nM, 62 nM, 93 nM, 140 nM, 210 nM, 316 nM, 474 nM, 711 nM, 1,06 kg, 1,2 kg, 1,4 kg, 1,6 kg, 2,4 kg.

mst-körningar utfördes med användning av standardbehandlade kapillärer (Nanotemper Cat#K002) på NT.115 monolit instrument. Alla mätningar utfördes med 80% LED och 40% MST-effekt, med 30 s Laser i tid och 5 s Laser off-tid. För varje experiment utfördes fem enkla mätningar.

Data analyserades med GraphPad Prism software version 6.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) och SigmaPlot software version 13.0 (Systat Software, San Jose, CA, USA). För peptidbindningsanalyserna, med kurvorna som visar en distinkt sigmoid-trend, monterade vi Richards fem Parameter logistisk Asymmetrisk sigmoid-ekvation och beräknade automatiskt Kd. För h3k9me3nucleosome-bindande analyser, som den rådata trenden var inte längre sigmoid för alla proteiner analyseras, en tredje ordningens polynom (kubisk) ekvation användes för montering och jämförelse av rådata punkter av vildtyp Chp1CD och de olika mutanterna. Kd beräknades baserat på Interpolationsfunktionen i GraphPad prism-programvaran, med användning av 50% bundet/obundet värde på y-axeln.

nukleosom trypsin digestion

svanslösa nukleosomer framställdes genom inkubering rekonstituerade nukleosomer med en immobiliserad tpck-Trypsin harts (Thermoscientific) för 2 h vid rumstemperatur i en buffert innehållande 20 mM HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT . Den tryptiska matsmältningen genererar mycket definierade histonband och det har karakteriserats i detalj där exakt trypsin skär .

Nukleosombindande analyser med Chp1CD mutanter

Chp1CD vildtyp och mutant nukleosombindande analyser utfördes som beskrivits tidigare för Chp1cd-H3KC9me3 MLA Nukleosomkomplex bildning i 20 mM HEPES pH 7,5, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT, 40 mM imidazol. Hartser och ingångar kördes på SDS-polyakrylamidgelelektrofores 15% akrylamidgeler. Alla prover analyserades sedan med immunoblot med anti-H3-Histon (AbCam, Cambridge, UK, 1:1000) eller anti-H3K9me3-antikropp (AbCam, 1:1000), Anti-get IgG-HRP (BioRad, 1: 3000) anti-kanin IgG – HRP (BioRad, Munich, Tyskland, 1:3000).

negativ fläckelektronmikroskopi

efter trombin eluering, 3 occyl av chp1cd–H3KC9me3 nukleosomer komplex sågs på en glöd-urladdat koppargaller (Cu 400 mesh Q11916, Quantifoil, Gro Occull Occylbichau, Tyskland) belagd med en 1 nm kolfilm för 45 s. efter en snabb tvätt med vatten, nätet inkuberades för 15 s i 2% Uranyl acetat. Negativa fläckbilder samlades på ett FEI Morgagni-transmissionselektronmikroskop.

Cryo-EM på chp1cd–H3KC9me3 nukleosomer komplex

Cryo-EM galler (Holey kolbelagda galler, Cu 300 Mesh R3/3+1 nm kolskikt, Quantifoil) framställdes med användning av en Vitrobot Mark IV (FEI Company). Cryo-EM-data samlades in med hjälp av ett Titan-Krios-transmissionselektronmikroskop (FEI Company, Hillsboro, OR, USA) vid 200 KeV och en förstoring på 113 000 kg vid CCD-planet med hjälp av en f816 CMOS-kamera (TVIPS GmbH, Gauting, Tyskland) vilket resulterade i en bildpixelstorlek på 1,2 kg per pixel på objektskalan (pixelstorleken på CCD var 13,6 kg). För automatiserad datainsamling användes EM-TOOLS-programvaran och data samlades in i ett defokusintervall på 10 000-40 000 kg.

totalt valdes 2 480 mikrografer för chp1cd–H3KC9me3-komplexet respektive 991 mikrografer för h3kc9me3-nukleosomkontrollen för enpartikelanalys med användning av xmipp-mjukvarupaketet (kompletterande figur S9A) . Några tusen partiklar plockades manuellt och rengjordes noggrant från buller. Dessa partiklar användes sedan för halvautomatisk och automatisk partikelplockning i XMIPP. Kontrastöverföringsfunktionen bestämdes av CTFFIND3 . Utvalda enstaka partiklar konverterades till spindel-och RELIONFORMAT för vidare analys (kompletterande figur S9B). De tvådimensionella klassgenomsnitten genererades med RELION mjukvarupaket (kompletterande figur S9C) . Dåliga klassmedelvärden togs bort från ytterligare dataanalys. De tredimensionella förfiningarna gjordes därefter med programvarupaketen SPIDER och RELION .

oövervakad partikelklassificering utfördes genom slumpmässig sådd med fullständiga täthetskartor utan fokuserad klassificering i SPINDELPROGRAMVARUPAKET. Försök att använda fokuserad klassificering resulterade i en stark bias och buller overfitting i regioner av intresse. Därför använde vi inte fokuserad klassificering för att minska bias. I den första klassificeringen gjord i SPIDER, klasserna C0–C6 och N0–N5 projicerades tillbaka med vinklar från C0-och N0-kartor och dessa klasser förfinades inte helt. Här ville vi bara välja klasser som hade ytterligare densitet bunden till nukleosomen. Partiklar som genererar kartor med olika chp1cd-densiteter separerades och klassificerades ytterligare. Cirka 20 rundor av slumpmässiga såddklassificeringar utfördes tills vi har delat upp partiklar i fem olika grupper (Tilläggsfigur S3). Klasserna C11-C15 förfinades med RELION mjukvarupaket. Slutliga förbättringar av Chp1CD-H3k9me3nukleosomkomplex (C15-klass) och Nukleosomkontroll gjordes med RELION-mjukvarupaket. För slutlig förfining filtrerades referensen till ~50 kcal (RELIONFILTER). Referensen vi använde hade ingen av de funktioner som observerats i raffinerade rekonstruktioner (DNA-dubbelhelixen är inte löst, huvudspåret är inte synligt, Bisexuell-spiraler löses inte). Detta indikerar ingen referensförspänning i vår struktur. Upplösningen av Nukleosomkontroll nådde 7,3 kg med hjälp av auto-förfina i RELION och C2 symmetri (FSC 0,143 cutoff av två oberoende raffinerade kartor). Chp1CD-H3k9me3nukleosomkomplexet raffinerades till 10 kcal (FSC 0,143 cutoff av två oberoende raffinerade kartor) utan symmetri applicerad.

lokal upplösning beräknades med hjälp av resmap-programvara (final single volume, minRes=7, maxRes=14, automask). Medelupplösning bestämd av Resmap är 9,4 Ghz för Chp1CD-H3k9me3nukleosomkomplex, vilket oberoende bekräftar tidigare bestämd Genomsnittlig upplösning på 10 xnumx xnumx (FSC 0,143) (figur 1C). För Chp1CD-H3k9me3nukleosomkomplex lokal upplösning för nukleosomen är 9-10 kg och för liganden ~10 kg (figur 2a). Euler vinkelfördelning för slutliga rekonstruktioner visas för både nukleosom och Chp1CD-H3k9me3nukleosomkomplex (kompletterande figur S9D). Alla riktningar är närvarande med en preferens för topp-och sidovyer.

molekylära modeller byggdes med Chimera mjukvarupaket med hjälp av styv kroppsmontering av kristallstrukturer . Passformen i densitet gjordes med Chimera-alternativen ’passa in i kartan’ och ’passa in segment’ med endast mindre manuella justeringar. Segmentering och visualisering av alla cryo-EM-kartor gjordes också med Chimera-programvara .