chimerismtestning används för rutinmässig dokumentation av engraftment och uppföljning efter transplantation av allogena transplantatmottagare. Donator-och mottagarceller kan särskiljas genom att testa genetiska markörer som bestäms före transplantationen.2. Vid könsmässiga transplantationer när mottagaren och givaren är av olika kön bestäms andelen kvinnliga och manliga celler vanligtvis genom analys av könskromosommarkörer, oftast med fisk.8,9 bedömning av variabelt antal tandemupprepningar (VNTR) eller korta tandemupprepningar (STR) med PCR har blivit den mest värdefulla metoden för bestämning av chimerism vid könsmatchade transplantationer.10 olika metoder har utvecklats för detektering av MRD. Morfologisk analys av märgen kan identifiera kvarvarande sjukdom som upptar mer än 5% av märgutrymmet och saknar således den nödvändiga känsligheten för tidig upptäckt. Det är också ofta svårt att skilja en liten leukemiblastpopulation från normala donator-härledda hematopoietiska blaster som återbefolkar märgen utan att använda ytterligare markörer. Specifika tester kan upptäcka MRD när det finns en specifik tumörmarkör såsom en specifik cytogenetisk abnormitet, en specifik immunofenotyp som kan identifieras med FACS, specifika DNA-eller RNA-sekvenser som kan förstärkas med PCR eller ett specifikt tillväxtmönster i klonogena analyser. I frånvaro av en specifik tumörmarkör för MRD kan chimerismtestning användas för att detektera mottagarderiverade celler. Detekteringen av mottagarderiverade celler kan inte alltid korrelera med risken för återfall. Mottagarceller som bidrar till blandad chimerism (MC) tillhör den maligna klonen eller kan vara normala hematopoietiska celler, eller till och med stromala celler. Under de första veckorna efter standard allogen transplantation kan mottagarceller fortfarande detekteras när känsliga tester används.9,11 dessa är mestadels T-celler som överlever konditioneringsregimen. Värdceller kan detekteras vid låga nivåer (<1%) även senare i posttransplantationskursen. MC detekteras oftare efter icke-myeloablativ konditionering.2 således är tumörspecifika markörsprober förmodligen överlägsna och mer exakta än könsmatchningsprober för detektering av MRD.12 men även detektering av MRD med tumörspecifika tester kan inte alltid korreleras med risken för återfall. Positiva PCR-test för BCR / ABL har rapporterats hos friska individer.13 T (14; 18) translokation detekterades i andra linjer än B-lymfocyter hos patienter med icke-Hodgkins lymfom.14 Det kan finnas en tröskel för att MRD ska vara kliniskt signifikant. I flera sjukdomar, såsom AML med t (8;21) har 15 långvariga remissioner observerats i närvaro av MRD detekterat av PCR, medan i andra, såsom vid akut promyelocytisk leukemi, förutsäger PCR-positivitet återfall.16 återigen kan detta relateras till känsligheten för det specifika PCR-testet och tröskeln till klinisk betydelse. Återstående maligna celler kan ha en vilande status17 som saknar potential att bidra till återfall, på grund av brist eller vinst av en andra genetisk förändring. I vissa sjukdomar kan partiell differentiering till mer mogna celler uppstå och dessa celler kan sakna potentialen att proliferera. MRD kan vara under immunövervakning, eller MRD-cellerna befinner sig i en apoptotisk fas som gör dem irrelevanta för återfall av sjukdomen. De känsliga PCR-testerna bevarar inte cellulär morfologi, och därför är det oklart vilka celler som korrelerar med MRD i dessa olika miljöer.
Duet-systemet för kombinerad samtidig morfologisk och cytogenetisk multiparametrisk analys erbjuder några fördelar som kan hjälpa till att avslöja relevansen av MRD-detektion. Detta system söker automatiskt ett stort antal celler (cirka 150000 celler per bild) för små cellulära delmängder med unik cytogentisk eller immunfenotyp. Känsligheten för detektering av små populationer ökar. I en serie utspädningsexperiment har vi visat att känsligheten för detektion av en manlig cell i en kvinnlig cellpopulation är högre än 1:50000, men på grund av begränsad specificitet i denna titer sker bästa detektion mellan 1:10000 och 1:50000 (se bilaga). Som framgår av analysen av benmärgsprover från patient 1 (sista analysen) och patient 2 kunde Duet-systemet detektera mycket små populationer av XY-mottagarceller som inte detekterats av rutinfisk. Fiskens kvantitativa noggrannhet är beroende av den observerade frekvensen och antalet celler som görs, vilket förbättras genom att göra fler celler.18 Scoring ett så stort antal celler är inte praktiskt med manuell fisk, men det automatiska systemet för Duet för Duet kan skanna 10000 celler/min i ljusfältmikroskopi och 2000-10000 celler / h i fluorescerande mikroskopi, vilket stöder behovet av snabb och effektiv skanning och ökad känslighet.
känsliga tester är ofta förknippade med minskad specificitet och en relativt hög falsk positiv frekvens. Med standardfisk kan falsk positiv poäng uppstå på grund av icke-specifik hybridisering av sonden. Falsk positiv poäng för kromosomala translokationer kan uppstå på grund av slumpmässig rumslig association och optisk fusion.18 Duet-systemet kan potentiellt förbättra specificiteten genom att identifiera morfologin hos cellerna i den sökta populationen. Detektion av fisk positivitet, i en liten population, men med en enhetlig duett exporterande morfologiska utseende gör det mer sannolikt att vara en sann positiv, än när positiva celler är utspridda inom olika, orelaterade härstamningar. Specificiteten för detektering av MRD med icke-specifik chimerismtestning kan också förbättras. Som diskuterats ovan kan mottagarceller tillhöra den maligna klonen (som hos patient 1), kan vara normala hematopoietiska celler (patient 3, patient 1 efter behandling med STI571) eller icke-hematopoietiska/stromala celler (såsom osteoblaster, patient 2). Duet-Systemet tillåter differentiering mellan dessa alternativ med det morfologiska utseendet. Vi har visat i analysen av patient 1 och ytterligare två patienter (data visas inte) att identifiering av mottagaregenskaper (såsom motsatt könscytogenetik) inom blaster eller omogna celler förutsäger Öppet återfall och föregår det med några veckor till några månader. I patient 1 separata FISKANALYSER avslöjade en liten XY-mottagarpopulation (0,6%) och en liten BCR/ABL-positiv population (0,8%) som båda kunde beaktas inom den falska positiva frekvensen för FISKANALYSEN. Duet-systemet har dock visat att en stor del av XY-mottagarcellerna var blaster (och även BCR/ABL-positiva med ett andra FISH-test på samma celler) och kunde därmed förutsäga att patienten är avsedd att återfalla. Identifieringen av en liten mottagarpopulation inom mogna hematopoietiska celler kan inte förutsäga återfall. Hos tre ytterligare patienter (data visas inte) har vi dokumenterat kontinuerlig remission i närvaro av en liten mottagarpopulation med mogen morfologi. Studier i större skala med längre uppföljning behövs för att bekräfta sambandet mellan morfologi hos kvarvarande värdceller och återfallsrisk hos patienter utan andra unika markörer för den maligna klonen.
systemet är relativt enkelt att använda, är mestadels automatiskt, dess utdelningstid och kostnader är jämförbara med andra system för chimerism och MRD-detektering, såsom standardfisk och PCR och det kan vara lämpligt för storskalig testning. Annat än systemets hårdvara och kit behövs endast standardutrustning som är lättillgänglig i stora laboratorier (se bilaga).
under de senaste åren har studien av chimerism inom olika cellulära delmängder fått intresse och popularitet.19,20 Detta är av yttersta vikt efter icke-myeloablativa transplantationer.2 Det har visats av vissa grupper att fullständig chimerism inom T-lymfocyterna krävs för induktion av GVL, och därför kan MC i denna cellulära delmängd associeras med ökad risk för återfall, särskilt av aggressiva, snabbt växande maligniteter.2,19 Chimerismtestning av cellulära delmängder behöver besvärlig och tidskrävande sortering av celler med den teoretiska potentialen att förlora vissa celler under den processen. Som diskuterats i bilagan beredning av diabilder för Duet Kazaki analys orsakar inte förlorat eller minskning av någon cellulär population. Duet-systemet använder mgg-färgad glid för att lokalisera lymfocyter och andra cellulära delmängder och kan också använda immunocytokemiska fläckar (såsom anti-CD3 monoklonala antikroppar) för att lokalisera dessa celler. I en andra fas, fisk kan tillämpas för chimerism testning i kön-inkompatibla transplantationer. Fallpresentationen av patient 3 visar hur systemet användes för att följa chimerism hos en patient efter icke-myeloablativ transplantation och hur omvandling till fullständig chimerism efter cyklosporinuttag förutspådde förekomsten av GVHD-och GVT-svar.
den här rapporten fokuserar på användningen av Duet bisexuell efter benmärgstransplantation, men det kan finnas många andra konsekvenser. Systemet kan också hjälpa till att studera celler och linjer som har en unik cytogenetisk eller immunofenotypisk markör, såsom BCR/ABL-fusion (som ses hos patient 1) och korrelerar deras morfologi med återfallsrisk efter standard kemoterapi. Det kan hjälpa till att avslöja arten av MRD i olika maligniteter och varför MRD-upptäckt inte alltid är förutsägbart för återfall. I vissa inställningar kan små donatorcellpopulationer eller mikro-chimerism sökas. Till exempel kan systemisk lymfhematopoietisk mikrochimerism detekterad efter fast organtransplantation förutsäga tolerans mot det transplanterade organet och rikta den immunsuppressiva behandlingen.21 små moderpopulationer som förorenar navelsträngsblodsallotransplantat kan också detekteras på ett liknande sätt och kan få konsekvenser för risken efter transplantation för GVHD.
Sammanfattningsvis, genom att lägga till morfologisk analys av små populationer av celler med malignitet eller mottagarassocierade markörer kan duetubbi-systemet förbättra noggrannheten för chimerism och MRD-testning och avgränsa deras kliniska betydelse. Detta system förtjänar ytterligare studier i större skala försök.