Chimärer

vad du kommer att ge del i

• ett kontonummer.
• en mykoplasmafri ES-cellinje med 40 kromosomer.

vad vi ska göra

• vi kommer att injicera cirka 50 blastocyster per ES-cellinje. Detta bör resultera i 10 möss födda. Tre av mössen förväntas vara starka manliga chimärer. Vi har ett bevisat rekord av framgång.
• vi kommer att hysa mössen fram till avvänjning (tre veckor efter födseln).

vad du kommer att ge Del II

• du kommer att hysa de avvanda mössen.

kostnad

• $3,300 per 129 cellinje och kostnaden för givarkvinnor; $4,950 per cellinje och kostnaden för givarkvinnor för andra genetiska bakgrunder.
• lokala, icke-CWRU-beställningar debiteras ytterligare $ 200 för packning och transport av möss. Icke-lokala beställningar debiteras $200 och transportkostnaderna.

regelefterlevnad

• utredare behöver ett iacuc-Protokoll från sin institution för att ta emot möss från kärnan. CWRU iacuc-protokoll måste specificera användningen av Case Transgenic Core. Utredare behöver inte ett eget IBC-protokoll, normalt: granskningen för rekombinant DNA hos djur kommer att genomföras på den information som skickas via onlinebeställning för den transgena kärnan, och kommer att läggas till kärnans IBC-protokoll som en ändring om det godkänns. Du kan kontaktas av IBC för ytterligare information som en del av rDNA review efter inlämning av beställningen. IBC-godkännande krävs innan injektioner påbörjas.

bekräftelser

• vi ber dig att erkänna Case Transgenic och Targeting Facility i seminarier och publikationer.

tidslinje

• från injektionsdatumet för celler kommer det att vara minst 6 veckor innan vi kommer att kunna leverera möss till dig (nästan 3 veckor för graviditet och minst 3 veckors postnatal tillväxt före avvänjning). Det kommer att vara ytterligare 6 veckor innan manliga chimärer kommer att vara gamla nog att föda upp, och minst ytterligare 6 veckor innan du kommer att ha avvänjat avkomma till genotyp för att testa för överföring av könslinjer-totalt 4.5 månader från injektion till testning för överföring av groddlinje.
• den nuvarande (3/25/21) förväntade tiden mellan orderplacering och ES-cellinjektion är 8 veckor. Under de 8 veckorna före injektionen granskas Chimera-begäran av IBC: s rDNA-utskott, ES-cellerna tinas och odlas och möss beställs och tas emot.

framgångsgrad vid generering av chimära möss

kärnan genererar i genomsnitt cirka 5 chimärer per cellinje.

komma igång
sannolikheten för könslinjeöverföring av en målinriktad mutation ökar med antalet tillgängliga oberoende ES-cellinjer. I genomsnitt kommer cirka två tredjedelar till tre fjärdedelar av ES-cellinjer på den 129 genetiska bakgrunden att gå bakterie. För ES – cellinjer på C57-bakgrunden kommer i genomsnitt endast en halv till två tredjedelar av linjerna att gå bakterie. Om du köper riktade ES-cellinjer från ett offentligt arkiv rekommenderar vi därför att du köper 3 eller fler korrekt riktade linjer på 129-bakgrunden och 4 eller fler rader på C57-bakgrunden. Likaså Beställa 2 eller fler injektioner för 129 linjer, och 3 eller mer för C57 linjer. För generering av vävnadsspecifika knockouts med villkorliga alleler i ES-celler från EUCOMM, se vår primer.

Vanliga frågor

vad är chimärer?
typiskt är chimärer konstruerade för att generera möss från geninriktade eller genfångade ES-cellinjer. ES-celler som injiceras i värdembryon ger upphov till mosaikmöss som kallas chimärer.
manliga ES-celler injiceras i osexuella blastocyster. Om värdembryot är kvinnligt och de manliga ES-cellerna gör bakterieceller, kommer chimären ofta att vara en bördig hane. Värdembryon från en stam som inte kommer att konkurrera för starkt med ES-cellerna används, och de två komponenterna (ES och värdembryo) är genetiskt märkta med pälsfärgener så att ES-cellernas bidrag till djuret lätt kan bestämmas. Om andelen ES – cellavkomlingar i djurets päls är hög är sannolikheten för att ES-celler representeras i könsceller också hög, eftersom ES-celler blandas noggrant med värdceller tidigt i embryogenesen. Pälsfärgsmarkeringssystemet gör det också möjligt att med lämpliga kors bestämma om chimärernas avkomma kommer från ES-cellkomponenten eller värdembryokomponenten.
129 ES-celler ger upphov till brun pälsfärg eftersom de är a/a (vildtyp Agouti) och C57BL/6J värdembryon ger upphov till svart pälsfärg eftersom de är a/a (recessiv nonagouti). ES-cellerna är från 129-stammen av möss; värdembryonerna är från C57BL/6J-stammen av möss. Om dessa chimärer föds upp till A / A-icke-agouti-möss (till exempel C57BL/6J, måste alla bruna avkommor (a/a) ha uppstått från ES-cell-härledda gameter, och 50% av de bruna avkommorna förväntas bära knockout-allelen. Alternativt kan överföringen av mutationen analyseras direkt med PCR eller Southern blot-analyser av vävnader från avkomman.
om ES-cellerna kommer från C57BL/6J-stammen (a/a, Tyr/Tyr och svart) kommer värdembryot att vara albino C57BL/6J (a/a, Tyrc-2J/Tyrc2-J och vit). Uppfödning av sådana chimärer till albino C57BL/6J kan generera svarta avkommor (a/a, Tyr/Tyrc-2J) från ES-cellkomponenten, varav 50% ska bära mutationen och vita avkommor (a/a, Tyrc-2J / Tyrc-2J) från värdembryokomponenten.

de manliga chimärerna som sannolikt kommer att överföra den riktade mutationen kan identifieras genom copulatorisk plugggenotypning.

chimärer för andra användningsområden
vi gör också aggregering chimärer och diploidtetraploid chimärer. Två preimplantationsembryon från två olika stammar av möss kombineras för att bilda en aggregeringskimera. Denna teknik kan användas för att generera genetiska mosaikembryon för analys av autonomi och nonautonomi av genverkan och andra experimentella mål. I diploidtetraploida chimärer ger den tetraploida komponenten till stor del upphov till mycket av den embryo-härledda moderkakan och den diploida komponenten till embryot. Denna typ av chimera kan användas för att bestämma om en gen krävs i placenta eller embryo.

Varför är mina möss roliga färger?
vissa ES-cellinjer är heterozygota för pälsfärgalleler som bara avslöjar sig i efterföljande generationer. De r1 129 ES-celler vi använder är heterozygota vid albino locus, som bär en kopia av chinchilla allel av albino (cch, även betecknad Tyrc-ch) och är heterozygota vid rosa ögon utspädning locus (p). Avel avkomma härstammar från R1 ES celler till varandra kan ge upphov till möss som är svarta, olika nyanser av grått, olika nyanser av brunt, eller gult, beroende på sortimentet av pälsfärg alleler.

vad kan göras för att säkerställa överföring av könsceller?
överföring av könsceller maximeras med ES-celler som har tillbringat en minimal tid i odling, som har ett normalt komplement av kromosomer och som är fria från jäst, bakterier och mykoplasma. Rikta in en cellinje som du vet överförs under dina förhållanden på din institution. Använd en föräldracellinje som har det lägsta tillgängliga passagenumret (helst mindre än passagenumret 16). Minimera den tid som den riktade linjen odlas. Kontrollera att riktade cellinjer har det normala antalet kromosomer. Testa din cellinje för mykoplasma. Vissa cellinjer kommer inte att sända även när alla dessa parametrar är till din fördel. Även under optimala förhållanden kommer endast två tredjedelar av riktade ES-cellinjer att överföras genom groddlinjen. Börja därför med minst tre oberoende riktade cellinjer för att säkerställa överföring.

jag har svaga chimärer / kvinnliga chimärer. Kommer de att sända knockout?
både svaga chimärer och kvinnliga chimärer kan överföra mutanta alleler, men sällan. Manliga chimärer som sannolikt kommer att överföra den riktade mutationen kan identifieras genom copulatorisk plugggenotypning. Endast cirka 10% av kvinnliga chimärer överför ES-cellgenomet, när de gör det är det bara i de första kullarna, och många av deras manliga avkommor har könskromosomaneuploidier som gör dem infertila (Bronson et al., 1995 PNAS 92, 3120).

varför dog mina starkaste chimärer?
dödligheten kan öka med andelen djur som kommer från ES-Celler, även för de bästa cellinjerna. Denna dödlighet beror till stor del på epigenetiska avvikelser som uppstod i kulturen. De epigenetiska avvikelserna tros korrigeras genom efterföljande avel av överlevande Möss och skulle segregera slumpmässigt bort från det riktade stället, även om de inte var det.

vilken stam av möss odlar jag mina mutanter till?
för att minimera genetisk variation så snabbt som möjligt föder upp chimärerna till samma bakgrund som ES-cellerna. Om ES-cellerna var 129, föda upp chimärerna till 129 Möss och din mutation kommer att vara helt på den 129 inavlade bakgrunden i ett steg. Den vanligaste inavlade bakgrunden för genetiska studier är C57BL / 6-stammen. Om dina ES-celler är C57BL/6, korsa dina chimärer till C57BL/6J-möss. Om du vill ändra bakgrunden är standarden att göra 9 seriella kors till den inavlade stammen av valet (ca 2,5 år). Motiveringen för de 9 generationerna förklaras här av Lee Silver. Alternativt krävs ungefär hälften av antalet generationer av markörassisterad backcross eller speed congenics.För maximal reproduktion, korsa dina möss på en outbred stam som CD1. CD1-möss härleddes från Schweiziska möss, har en hög grad av genetisk variation och valdes för robust reproduktion.

ES-celler med villkorliga alleler från EUCOMM
varje cellinje från EUCOMM kräver att du fyller i ett Materialöverföringsavtal. Starta denna process så tidigt som möjligt.
generationstiden för möss och antalet korsningar som är nödvändiga för att generera experimentella möss kombineras till en tid som är överraskande för dem som inte är vana vid musgenetik, så planera framåt. Generationstiden för möss (tiden från sexuellt mogen vuxen till sexuellt mogen avkomma) är cirka 3 månader.
EUCOMM villkorliga alleler har vanligtvis en Frt-flankerad kassett (en ”Frt-ed” kassett). Kassetten har en skarvacceptor som avleder praktiskt taget all skarvning i kassetten, vilket gör allelen till en funktionsförlustmutation i denna konfiguration. För att generera den villkorliga allelen måste den Frt-flankerade kassetten tas bort genom att korsa till flpe-Uttryckande möss. Flpe / Frt-systemet är jämförbart men skiljer sig från Cre/LoxP-systemet.
vi kommer att injicera ES-cellerna i värdembryon för att göra chimära möss. Därifrån kommer du att odla mössen för att generera möss som bär mutationen (germline transmission). Denna grundargeneration av möss kan korsas till möss som uttrycker Flpe för att ta bort Frt-ed-kassetten och generera den villkorliga allelen. Då måste du göra flera fler kors för att generera experimentella möss.

1. från ES – cellinjektion till vuxna sexuellt mogna chimärer är generationstiden för möss (3 månader).
2. chimärerna föds upp till möss av vildtyp för att etablera mutanten i groddlinjen (3 månader).
3. de heterozygota frtd-villkorliga mössen korsas till Flpe som uttrycker homozygoter. Detta genererar Flpe/ den, frtd villkorlig / + avkomma. (3 månader)
4. Flpe / o, frtd-villkorliga / + – möss korsas till vildtyp för att fastställa den utskurna allelen i groddlinjen och föda upp Flpe, och excision verifieras molekylärt i dessa villkorliga/+ – möss (3 månader).
5. de villkorliga / + mössen uppföddes sedan till varandra för att göra homozygota villkorliga allelmöss (3 månader).
6. de villkorliga / villkorliga mössen föds upp till vävnadsspecifika-Cre/ vävnadsspecifika-Cre, null/+ möss för att göra experimentntal vävnadsspecifika-Cre/o, villkorliga/nollmöss och kontrollvävnadsspecifika-Cre/ o, villkorliga / + möss.

dessutom måste fple, null, Cre-möss erhållas, de vävnadsspecifika-Cre/ vävnadsspecifika-Cre, null / +-mössen måste uppfödas.
den villkorliga allelen bör också analyseras för att avgöra om den är vild typ i funktion före excision med Cre och null efter excision med Cre. För att avgöra om den villkorliga allelen är vild typ i funktion före excision, villkorliga/villkorliga och villkorliga/null mutanter bör undersökas för att avgöra om deras fenotyp är densamma som +/+ och null/+ möss respektive. För att avgöra om Cre-excised conditional är en null-allel korsas conditional till en grodd Cre-mus och de utskurna conditionals korsas för att testa om fenotypen för utskurna conditional/excised conditional är densamma som null/null och/eller att inget protein tillverkas av den utskurna conditional allelen.
en reporter av Cre-aktivitet som RosaReporter, eller mer idealiskt, visar direkt att proteinet av intresse är frånvarande från målcellerna genom immunofluorescens är en viktig kontroll. RosaReporter genererar permanent beta-galaktosidas uttryck i alla celler som exponerades för Cre.
överdrivet Cre-uttryck kan leda till kromosombrott som kan orsaka fenotyper som inte är relaterade till funktionen hos den villkorliga allelen. Därför är syskonmöss som uttrycker Cre men behåller viss genfunktion (till exempel villkorad/+) en viktig kontroll.