1.4.1 Homogeniseringsmedium
Cellstörning utförs vanligtvis i antingen ett något hypo-osmotiskt eller ett iso-osmotiskt medium för att bevara morfologisk integritet. Sackaros används ofta som ett osmoticum för att förhindra subcellulära organeller eller vesiklar från negativ svullnad eller krympning. Mannitol och sorbitol har också använts när sackaros har visat sig störa den biokemiska analysen av den subcellulära komponenten. Sackaros föredras framför saltlösningar eftersom de senare tenderar att aggregera subcellulära organeller. Hypo-osmotiska medier används ofta vid isolering av plasmamembranfraktioner eftersom störda celler under dessa förhållanden ger plasmamembran i form av stora spöken eller ark. Detta minskar signifikant den höga graden av variation i storlek av dessa Fragment före centrifugering. Även om homogeniseringsmediet vanligtvis är vattenhaltigt, har icke-vattenhaltiga medier såsom eter / kloroform använts för att isolera subcellulära organeller. Icke-vattenhaltiga medier kan emellertid inaktivera vissa enzymer och minska morfologisk integritet hos vissa vävnader.
kelaterande medel (EDTA eller EGTA) kan tillsättas till homogeniseringsmediet för att avlägsna tvåvärda katjoner, såsom Mg2+ eller Ca2+ som krävs av membranproteaser. Det är viktigt att notera att proteashämmare fortfarande bör inkluderas i mediet eftersom EDTA-och tiolreagens kan aktivera vissa proteolytiska enzymer. Emellertid kräver många membranmarkörenzymer dessa katjoner för aktivitet och kan hämmas efter att katjonerna har tagits bort från extraktet. Tillsatsen av Mg2 + eller Ca2+ till homogeniseringsmediet upprätthåller kärnkraftsintegritet. Dessa joner kan emellertid orsaka membranaggregering och minska andningskontrollen i mitokondrier.
cellstörning av växtvävnad frigör ofta fenoler som kan ha flera skadliga effekter på växtenzymer. Växtfenolföreningar består i huvudsak av två grupper: fenylpropanoidföreningar (t.ex. hydrolyserbara tanniner) och flavonoiderna (t. ex. kondenserade tanniner). Fenolerna kan vätebindas med peptidbindningar av proteiner eller genomgå oxidation med fenoloxidas till kinoner. Kinoner är kraftfulla oxidationsmedel som också tenderar att polymerisera och kondensera med reaktiva grupper av proteiner för att bilda ett mörkt pigment som kallas melanin som utgör grunden för brunning av växtvävnad. Attachment av melanin till proteiner kan inaktivera många enzymer. Fenoliska hydroxylgrupper kan bilda Joniska interaktioner med basiska aminosyror av proteiner eller interagera hydrofobt med hydrofoba regioner av proteiner. Därför är det viktigt att avlägsna fenolföreningarna så snabbt som möjligt och detta uppnås bäst genom att använda adsorbenter som binder till fenolerna eller kinonerna eller genom att använda skyddsmedel såsom Borat, germanat, sulfiter och merkaptobensotiazol som hämmar fenoloxidasaktiviteten. Fenol adsorbenten, polyvinylpyrrolidon i antingen vattenlöslig form eller som den mycket tvärbundna olösliga produkten Polyclar kan tillsättas till isoleringsmediet. Polyvinylpyrrolidon binder de fenolföreningar som bildar starka vätebindningar med proteiner. Bovint serumalbumin har också rapporterats reagera med växtfenoler och är också en effektiv kinonavskiljare.
cell-eller vävnadsfraktionering utförs alltid vid +4 kcal C för att minska aktiviteten hos membranproteaser. Proteaser kan delas in i endopeptidaser och exopeptidaser. Endopeptidaser, som är enzymer som klyver interna peptidbindningar, inkluderar: syraproteaser som har ett pH optima av pH 2,5–3,8 och kan hämmas av övergångstillståndshämmaren pepstatin; serinproteaser som kan hämmas av diisopropylfluorfosfat och fenylmetylsulfonylfluorid; och sulfhydrylproteaser som hämmas av N-etylmaleimid eller E-64 (l-trans-epoxysuccinyl-leucylamid-butan). Exempel på exopeptidaser inkluderar karboxipeptidaser som finns i de flesta växtvävnader och lätt hydrolyserar de flesta C-terminala aminosyror. Alla växtkarboxipeptidaser som hittills studerats hämmas av diisopropylfluorfosfat. Aminopeptidaser, dipeptidaser och tripeptidaser har också identifierats i växter. Andra föreningar som används i homogeniseringsmedier inkluderar disulfidreducerande medel såsom 2-merkaptoetanol, ditiotreitol, ditioerytritol, reducerad glutation eller cystein. Detta beror på att många enzymer innehåller en väsentlig aktiv plats sulfhydrylgrupp som måste förbli reducerad för att upprätthålla enzymaktivitet. Många av problemen med organellisolering är förknippade med bristning av de bräckliga membranen, till exempel tonoplasten som omger vakuolen. Bortsett från den fysiska förstörelsen av dessa membran innehåller växtvävnader aktiva lipolytiska enzymer som kan attackera lipidkomponenterna i membran direkt och störa organeller. Fria fettsyror som frigörs genom hydrolytisk verkan av acylhydrolaser kan hämma ATPas-aktiviteter i mitokondrier, kloroplast och plasmamembran. Andra skadliga effekter av fettsyror är också väl etablerade. Det finns vissa tillstånd som kan minska lipidnedbrytningen genom lipaser och lipolytiska acylhydrolaser i växter. Dessa inkluderar användning av (1) ett isoleringsmedium med ett pH på 7.5-8 där de flesta lipolytiska enzymer och lipooxygenaser uppvisar liten aktivitet, (2) kelaterande medel såsom EDTA eftersom många fosfolipaser är Ca2+ beroende; många lipolytiska enzymer påverkas emellertid inte av kelaterande medel och (3) andra tillsatser såsom antioxidanter för att förhindra oxidativ nedbrytning av fettsyrahydroperoxider, disulfidreducerande medel, specifika enzymhämmare och användningen av fettsyrafritt bovint serumalbumin som binder fria fettsyror. Varje enskilt homogeniseringsmedium är annorlunda och kan innehålla specifika hämmare för enzymer såsom fosfolipaser eller fosfataser. Glycerol till exempel tillsätts ofta till isoleringsmediet för att hämma fosfatidinsyrafosfatas. Etanolamin och kolinklorid används ofta för att hämma fosfolipas D.
buffertkapaciteten hos homogeniseringsmediet för växtcellsfraktionering måste vara hög för att kompensera frisättningen av organiska syror av den störda vakuolen som utgör en väsentlig volym av cellen. Homogeniseringsmediet kan antingen formuleras genom empirisk utvärdering eller genom rationell analys. Till exempel, för att säkerställa att det relevanta renade proteinet förblir intakt kan alla större hämmare av proteaser tillsättas till homogeniseringsmediet eller alternativt kan fysiologiska lösningar kopieras. Eftersom växtcellens cytoplasmatiska pH är cirka 7,5-8,0, bör homogeniseringsmediet återspegla cellens fysiologiska tillstånd och därför svagt buffras till det cytoplasmatiska pH.