i den här videon kommer du att observera hur man utför kromfrisättningsanalysen och bestämmer effektorcellernas cytotoxiska potential.
immunceller är ansvariga för att identifiera och ta bort potentiellt skadliga celler, som cancer eller virusinfekterade celler, från kroppen, vilket är en integrerad del av immunsvaret. Flera immunceller, som T-celler och NK-celler, har en egenskap som kallas cytotoxisk potential, vilket är förmågan att identifiera målceller och utsöndra proteiner som inducerar proteinnedbrytning, Lys och död hos dessa målceller. Kvantifiering av cytotoxisk potential är avgörande för mätning av immuncellaktivering och potens, och kromfrisättningsanalysen används vanligtvis för detta ändamål.
denna metod gör det möjligt för användare att jämföra cytoxicitet inducerad av specifika typer av immunceller under olika förhållanden, vilket är värdefullt för att studera cancerimmunterapi och immunitetsrelaterade sjukdomar. Till att börja med inkuberas målcellerna, som cancerceller, med en radioaktiv isotop, krom 51, som tas upp av cellerna. Därefter samodlas dessa radiomärkta celler med de isolerade immuncellerna av intresse, även kallade effektorcellerna, i en rund botten, 96 – brunnsplatta för att underlätta interaktion mellan de två celltyperna.
den övergripande inställningen av analysen innefattar inkubering av ett specifikt antal målceller med olika koncentrationer av immuncellerna, tillsammans med lämpliga kontroller. Samkulturen tillåter effektorcellerna att inducera apoptos och LYS i målcellerna, vilket resulterar i frisättning av det intracellulära kromet 51 i supernatanten. Sedan, vid en föroptimerad tidpunkt, skördas supernatanten som innehåller det frigjorda kromet från alla brunnarna. Krom 51, som är radioaktivt, genomgår spontant radioaktivt sönderfall för att avge gammastrålning. Gammastrålningsnivåerna i supernatanterna från alla brunnar i analysplattan representerar en kvantifierbar utgång från lysen av målcellerna. Detta mäts med hjälp av en gamma-räknare, som sedan används för att bestämma immuncellernas cytotoxiska potential.
för att börja, målcellerna, humant melanomcellinje WM793 i detta exempel, framställs i en enda cellsuspension. För att göra detta, ta först bort mediet från vävnadskulturkolven och tvätta cellerna med fem milliliter 1x PBS. Dekantera PBS och tillsätt sedan en milliliter trypsin till plattan i ungefär två minuter. Knacka försiktigt på kolven för att lossa cellerna från kolvytan och tillsätt sedan fem ml RPMI-media i kolven. Pipettera mediet upp och ner för att samla cellerna och tillsätt denna suspension till ett 15 ml koniskt rör.
placera röret i centrifugen i fem minuter vid 1200 RPM. Ta sedan bort mediet från röret och se till att inte störa cellpelleten. Bläddra försiktigt i rörets botten för att störa cellpelleten och tillsätt 10 ml media till röret. Pipettera sedan försiktigt mediet upp och ner för att bringa cellerna i suspension. Därefter bestämmer du cellkoncentrationen med hjälp av en hemocytometer och överför två milliliter av den ursprungliga cellsuspensionen till ett nytt 15 ml koniskt rör. Placera röret i en centrifug och pelletar cellerna vid 12 hundra varv per minut i fem minuter. Efter centrifugering, häll överskottsmediet ur röret i en avfallsbehållare. Kort virvel röret för att resuspendera cellpelleten i den lilla volymen av medium kvar.
Förbered dig sedan på att använda Chromium 51 genom att flytta till ett labbutrymme dedikerat för denna speciella radioaktivitet. Det bör finnas gott om blyskärmning för säker lagring och användning av krom 51 under alla steg, samt korrekt skyltning för att indikera var prover med krom 51 hålls. En Geiger-räknare utrustad med en pannkaka-sond är också nödvändig för att tjäna i utrymmet för eventuell förorening.
när du har ställt in för korrekt användning av radioaktivitet, Lägg till 100 mikrokurier av krom 51 direkt till målcellsuspensionen. Lägg sedan till en liten bit radioaktiv tejp i röret för att indikera att provet och röret nu är radioaktiva. Placera röret i en inkubator på 37 grader celsius med en blysköld och inkubera i en timme och snärta röret var 15 till 20 minuter.
medan målcellerna märker, förbered en enda cellsuspension av effektorceller. I detta exempel isolerades humana perifera blodmonokärnceller, eller PDMCs, från helblod genom standarddensitetsgradientcentrifugering till en koncentration av 5 gånger 10 till den 6: e. Överför denna effektorcellsuspension till en engångsreagensbehållare och tillsätt sedan 200 mikroliter av denna suspension i varje brunn i rad B i en 96-brunns rundbotten platta. Lägg sedan till 100 mikroliter RPMI till varje brunn i rad C till g av plattan.
börja nu utföra seriella utspädningar av Pbmc: erna för att ha ett intervall av effektorcellnummer genom att först ta bort 100 mikroliter av cellerna i brunnarna i rad B och lägga till detta i rad C. späd sedan effektorcellerna ytterligare genom att överföra 100 mikroliter celler från rad C till rad D. fortsätt den seriella utspädningen. När rad G har uppnåtts flyttar du 100 mikroliter från brunnarna för att lämna en slutlig volym på 100 mikroliter i varje brunn i den raden. Lägg sedan till 100 mikroliter vävnadsodlingsmedium till brunnarna i rad A för att fungera som en kontroll för spontan frisättning av krom 51 Från målcellerna, eftersom inga effektorceller bör läggas till denna rad. Placera sedan en platta i en inkubator på 37 grader celsius tills målcellerna är redo att tillsättas.
efter inkubationsperioden, ta bort målcellerna från inkubatorn och tvätta med 5 ml FBS för att avlägsna eventuellt överskott av krom 51. Placera sedan röret i en utsedd centrifug och snurra vid 1200 rpm i 5 minuter. Ta bort den radioaktiva FBS-tvätten i en lämplig avfallsbehållare och upprepa tvättsteget genom att återsuspendera pelleten i en färsk 5 ml FBS. Placera röret i en utsedd centrifug och snurra cellerna igen vid 1200 rpm i 5 minuter. Ta bort den andra tvätten och kontrollera pelleten för inbyggd radioaktivitet med en Geiger-räknare. Slutligen, Omsuspendera pelleten i 10 ml komplett medium och häll krom 51 märkt, målcellsuspension i en engångsreagensbehållare. Lägg sedan till 100 mikroliter av dessa märkta målceller till varje brunn i 96-brunnseffektorcellplattan. Lägg sedan till 100 mikroliter av 1% NP-40 i vatten till brunnarna i rad H för att lysa alla målceller denna varje rad. Dessa brunnar kommer att användas som en kontroll för att bestämma de totala räkningarna per minut, eller cpm.
nu när plattan är förberedd, säkra locket genom att lägga till en liten bit tejp på vardera sidan av plattan och placera en bit radioaktiv tejp på locket för att indikera att den innehåller krom 51. Placera sedan plattan i en centrifug märkt för att hantera radioaktiva prover. Om endast en experimentell platta används, Lägg till en balansplatta i centrifugen. Ställ centrifugen till 1200 rpm och ta upp plattan till hastighet. En gång i hastigheten, stoppa maskinen. Ta bort plattan från centrifugen. Placera sedan plattan i en inkubator på 37 grader celsius med en liten bit blyskydd över plattan för ytterligare säkerhet. Inkubera i 16 timmar för att låta målcellerna lysa.
vid slutet av inkubationsperioden, ta försiktigt bort tejpen runt kanten på plattan och ta bort locket. Placera sedan skördramen på plattan och se till att de små filterskivorna är på plats för var och en av bomullspluggarna. Tryck nu långsamt och försiktigt bomullspropparna i brunnarna. Efter ungefär tio sekunder släpper du trycket på bomullspluggarna och överför sedan bomullspluggarna till rörremsor. Placera vart och ett av dessa rör i ett sekundärt FACS-rör. Slutligen ladda FACS-rören på en gamma-räknare och kör proverna för att kvantifiera mängden krom 51 som frigörs i varje tillstånd. Registrera försiktigt den ordning i vilken rören laddades in i räknaren.
här tillsattes ostimulerade Pbmc till de första 3-banorna och CPG-stimulerade Pmbc tillsattes till körfält 4 till 6. I det här exemplet infördes räkningarna per minut i cellerna i ett kalkylblad på samma sätt som proverna lades ut i originalplattan och medelvärdena för triplikaten beräknades. Till exempel, för det första tillståndet, var cellerna A1, A2 och A3 i genomsnitt i cell i3. När medelvärdena har bestämts kan procenten av specifik Lys för varje tillstånd beräknas med hjälp av denna formel. Till exempel för att beräkna den procentuella specifika lysen för de ostimulerade cellerna som hade ett förhållande mellan 50 och 1 effektorceller för att rikta celler den spontana CPM, som i detta exempel är 1164,67, subtraherades från den experimentella CPM, 1129. 67. Detta tal kan sedan divideras med skillnaden mellan maximal CPM och spontan CPM och multipliceras sedan med 100 för att ge den procentuella specifika lysen. Detta beräknas sedan för varje villkor. Dessa data kan sedan graferas för att visa jämförelse av e till T-förhållandet med den procentuella specifika lysen för både de ostimulerade Pbmc: erna och CPG-stimulerade Pbmc: erna. I detta exempel dödade effektorceller stimulerade med CPG mer effektivt målceller när förhållandet mellan effektorceller och målceller ökade. Denna ökning observerades inte i de ostimulerade Pbmc: erna, vilket indikerar att CPG-stimulering är nödvändig för den observerade ökningen av målcelllys.