fundal: leucemia limfocitară cronică (CLL) are un imunofenotip clasic, format din restricție de lanț ușor, CD5+, CD19+, DIM CD20, CD23+, CD43+, CD200+, CD10 – și CD79b-. Acest lucru îl deosebește de celulele B normale și de alte tulburări limfoproliferative (LPDs). Anticorpii care vizează acești antigeni sunt incluși în două panouri de citometrie în flux cu 8 culori dezvoltate de consorțiul Euroflow pentru elaborarea LPD-urilor cu celule B. Combinarea acestor anticorpi într-un panou de 10 culori ar fi mai rentabilă. Mai mult, noile terapii LLC pot induce remisiuni profunde, creând o cerere tot mai mare de măsurare a bolii reziduale minime (MRD), definită ca având peste 1 celulă leucemică reziduală la 10.000 de leucocite (10-4). Abordarea standardizată internațională actuală pentru măsurarea MRD stabilită de inițiativa europeană de cercetare privind CLL (ERIC) utilizează un grup de anticorpi care vizează CD3, CD5, CD19, CD20, CD22, CD43, CD79b și CD81. Cu toate acestea, aceste combinații anticorp-fluorocrom sunt diferite de cele utilizate de panourile de diagnosticare Euroflow. Astfel, laboratoarele care au în vedere implementarea testării MRD ar trebui să achiziționeze anticorpi pentru 3 panouri diferite (2 diagnostice și 1 MRD). Am extins tubul de screening al limfocitelor Euroflow cu 8 culori (lst) pentru a include CD200 și CD23, astfel încât CLL poate fi detectat într-un tub de 10 culori, la niveluri de până la 0,01%. Scopul acestui studiu a fost de a determina economiile potențiale de costuri în implementarea acestui nou panou și de a determina dacă este suficient de sensibil pentru a detecta MRD.
metode: am calculat numărul de probe analizate cu tubul lst modificat în 10 culori (mLST1, obținut liofilizat) din aprilie 2018 până în martie 2019 pentru a exclude un LPD și numărul de alicote de anticorpi salvate folosind această abordare comparativ cu metoda standard Euroflow cu 2 tuburi. De asemenea, am creat o versiune a panoului menționat mai sus (mLST2) folosind anticorpi lichizi pentru a crește generalizarea rezultatelor noastre, înlocuind CD38 cu CD43 pentru a vedea dacă această detectare MRD îmbunătățită (vezi panourile de mai jos). Pentru testarea MRD, am folosit probe de LLC de la 24 de pacienți diferiți pentru a produce 60 de probe MRD la diferite concentrații de celule leucemice. Probele au fost preparate prin spiking celule LLC în suspensii de leucocite normale la concentrații aproximative de 0,1%, 0,01% și 0,001%. Fiecare probă a fost alicotată și colorată cu cele trei panouri: ERIC, mLST1 și mLST2. Datele au fost obținute utilizând un bd FACSCanto II sau o fuziune bd FACSAria și analizate utilizând software-ul bd FACSDiva. Celulele LLC au fost identificate pe baza expresiei diferențiale a markerilor cheie și MRD a fost calculat ca număr de celule LLC/leucocite totale. Pozitivitatea MRD a fost definită ca 0,01%. Acordul dintre panouri a fost evaluat folosind metoda bland-Altman plot. De asemenea, am calculat acordul procentual dintre panouri în identificarea pozitivității MRD.
rezultate: în 1 an, mLST1 a fost efectuat pe 474 de probe, dintre acestea 220 au avut un LPD și 123 (56%) au avut un fenotip CLL clasic, evitând necesitatea unor teste suplimentare. Acest lucru a dus la economii nete de 476 de alicote de anticorpi. Pentru evaluarea MRD, expresia diferențială a CD5 și CD20 au contribuit cel mai semnificativ la diferențierea LLC de celulele B normale folosind mLST1 și mLST2. Am identificat un caz de LLC cu un imunofenotip atipic (dim CD5, bright CD20) care s-a dovedit dificil de poarta folosind un panou mLST. S-a ajuns la un acord în ceea ce privește rezultatele MRD obținute cu panelurile mLST și cu panelul ERIC. Pentru valorile care depășesc limita de cuantificare, limita de acord de 95% a fost de 0,3369 log-uri pentru comparația ERIC vs mLST1 și de 0,3485 log-uri pentru comparația ERIC vs mLST2. Astfel, variabilitatea nivelurilor MRD între panouri a fost mai mică de 2 ori mai mare decât majoritatea timpului, ceea ce am considerat acceptabil clinic, deoarece MRD este măsurat pe o scară exponențială. Grupul ERIC și mLST1 au avut un acord de 88,3% în ceea ce privește diferențierea eșantioanelor MRD-pozitive față de MRD-negative. Acordul a fost de 93,3% între grupul ERIC și mLST2.
concluzii: utilizarea unui panou lst modificat în 10 culori atât pentru diagnostic, cât și pentru măsurarea MRD a LLC este fezabilă. Avantajele sunt familiarizarea sporită cu anticorpii și economiile potențiale de costuri, făcând MRD accesibil mai multor laboratoare de citometrie. Cazurile CLL atipice fără pozitivitatea CD5 obișnuită și CD20 dim sunt foarte dificil de purtat folosind un panou lst. În aceste cazuri, panoul ERIC este clar superior, deoarece CD22, CD79b, CD81 și CD43 pot asigura în continuare separarea între limfocitele maligne și cele normale.
Bazinet:bd Biosciences: Altele: a furnizat gratuit o cantitate semnificativă de anticorpi utilizați în acest proiect.. Wever: Teva Canada Inovație: Ocuparea forței de muncă. Gimmig: bd Biosciences: ocuparea forței de muncă. Johnson:Lundbeck: Ocuparea Forței de muncă, onoare, calitatea de membru în Consiliul de Administrație sau comitetele consultative ale unei entități, altele: taxe de călătorie, cadouri și altele, finanțarea cercetării; Merck: consultanță, onoare; Roche: consultanță, angajare, onoare, calitatea de membru în Consiliul de Administrație sau comitetele consultative ale unei entități, altele: taxe de călătorie, cadouri și altele, finanțarea cercetării; Abbvie: consultanță, angajare, onoare, calitatea de membru: Cu condiția ca o proporție semnificativă a anticorpilor utilizați în acest proiect să fie gratuită.; BMS: consultanță, Honoraria; Seattle Genetics: Honoraria.