teste simplificate ChIP-exo

anticorpi

IgG iepure (Sigma) conjugat cu Dynabeads a fost utilizat împotriva tulpinilor tap-TAG în care tap-tag-ul care conține proteina a a fost ținta. Anticorpul Millipore 07-729 a fost utilizat împotriva probelor K562 care vizează CTCF.

Tn5 purificare

un construct personalizat de Tn5 E54k E110K P242A L372P14 într-un vector pET-45b( + ) a fost comandat (GenScript) pentru a exprima Tn5 hiperactiv cu un N-terminal his6-tag. Plasmida este disponibilă la Addgene (Id Addgene: 112112). Celulele E. coli competente BL21 (de3) (New England Biolabs) au fost transformate și o singură colonie a fost cultivată la 37 centimetric C până la un OD600 de 0,4 în 500 ml LB + 50 centimetric/ml ampicilină + 30 centimetric/ml cloramfenicol. Celulele au fost transferate într-un incubator de 25 C și induse cu izopropil-0,5 mm-D-galactopiranozidă timp de 4 ore. celulele au fost colectate prin centrifugare, spălate o dată cu tampon ST, iar peleta celulară a fost înghețată flash în azot lichid.

Tn5 a fost purificat conform descrierii anterioare10, cu puține modificări. Pe scurt, celulele au fost omogenizate în 10 volume (ml/g) de tampon Tegx100 (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCI, 1 mm EDTA, 10% glicerol, 0,1% Triton-X 100) conținând IPC și fluorură de fenilmetilsulfonil de 100 mm și lizate prin incubare cu lizozimă (Sigma; 1 mg / 1 g de pelete celulare) la temperatura camerei timp de 30 min. Lizatul a fost centrifugat la 20.000 XTX g timp de 20 min la 4 XTX C, iar supernatantul a fost precipitat cu 0,25% polietilenimină (Sigma) și centrifugat la 10.000 XTX g timp de 15 min. Supernatantul a fost apoi precipitat cu sulfat de amoniu cu saturație de 47% (0.28 g/ml) pe o perioadă de incubare de 30 de minute, apoi centrifugată la 20.000 de centi g timp de 15 minute.

peleta a fost apoi omogenizată în 50 ml tampon de încărcare cu afinitate de nichel (50 mM fosfat de potasiu, pH 7,4, 50 mm KCl, 20% glicerol) și încărcată pe o coloană HISTRAP HP (GE Healthcare; 5 ml) la 1,5 ml/min echilibrat cu același tampon. Coloana a fost spălată secvențial cu tampon de spălare I (50 mm fosfat de potasiu, pH 7,4, 1 m KCl, 50 mM imidazol, 20% glicerol), tampon de spălare II (50 mM fosfat de potasiu, pH 7.4.500 mM KCl, 50 mM imidazol, 20% glicerol) și apoi Tn5 a fost eluat cu tampon de eluție cu afinitate de nichel (50 mm fosfat de potasiu, pH 7, 4.500 mM KCl, 500 mm imidazol, 20% glicerol) la 2 ml/min. Eluatul a fost diluat la 300 mm KCl cu tampon de diluare (50 mM fosfat de potasiu, pH 7,4, 20% glicerol), iar volumul final a fost ajustat la 50 ml cu tampon TEGX300 (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 300 mM Naci, 1 mm EDTA, 10% glicerol, 0,1% Triton-X 100).

apoi, proba a fost încărcată pe o coloană HITRAP Heparin HP (GE Healthcare; 1 ml) echilibrată cu TEGX300 la 1 ml/min. După spălarea cu 5 volume de coloană de tampon, a fost rulat un gradient NaCl liniar de 10 ml (300 mM până la 1,2 m) pentru a Eluta. Tn5 eluat din coloană la aproximativ 600 mm Naci. Fracțiile care conțin vârful principal de eluție au fost combinate (3,5 ml) și dializate peste noapte împotriva tamponului TEGX300 care conține 30% glicerol și apoi depozitate la -80 C.

preparat de cromatină de drojdie

tulpinile Saccharomyces cerevisiae marcate cu TAP (Biosystems deschise) au fost cultivate în 500 ml de mediu de dextroză peptonă de drojdie la un OD600 = 0,8 la 25 C. Celulele au fost reticulate cu formaldehidă la o concentrație finală de 1% timp de 15 minute la temperatura camerei și au fost stinse cu o concentrație finală de 125 mm glicină timp de 5 minute. Celulele au fost colectate prin centrifugare și spălate în 1 ml de tampon ST (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM Naci) la 4 centimetric C și împărțite în două alicote. Celulele au fost granulate din nou, supernatantul a fost îndepărtat, iar peleta a fost înghețată.

o alicotă de cultură de 250 ml a fost lizată în 750 unqq de tampon de liză FA (50 mm Hepes-KOH, pH 7,5, 150 mM Naci, 2 mm EDTA, 1% Triton, 0.1% deoxicolat de sodiu și IPC) și 1 ml volum de 0,5 mm mărgele de zirconiu/silice prin bătăi de mărgele într-o mașină Mini-Beadbeater-96 (Biospec) timp de trei cicluri de 3 min cicluri on/5 min off (probele au fost ținute pe gheață în timpul ciclului off). Lizatul a fost transferat într-un tub nou și microcentrificat la viteză maximă timp de 3 min la 4 centimetric C pentru a peleta cromatina. Supernatantul a fost aruncat, iar peleta a fost omogenizată în 750 unqtl de tampon de liză FA suplimentat cu 0,1% SDS și transferat într-un tub conic de polistiren de 15 ml. Eșantionul a fost apoi sonicat într-un Bioruptor (Diagenode) timp de 15 cicluri cu intervale de pornire/oprire de 30 s pentru a obține fragmente de ADN de 100 până la 500 bp în dimensiune. Un test ChIP-exo a procesat echivalentul unei culturi celulare de 50 ml (~6 celule 108). Aceasta reprezintă o sumă convenabilă, mai degrabă decât o sumă minimă necesară.

k562 preparat de cromatină

celulele leucemiei mieloide cronice umane (K562, ATCC) au fost menținute între 1 CTF 105 și 1 CTF 106 celule/ml în medii DMEM suplimentate cu 10% ser fetal bovin la 37 CTF C cu 5% CO2. Celulele au fost spălate cu PBS (8 mm Na2HPO4, 2 mm KH2PO4, 150 mM NaCI și 2,7 mM KCl), apoi reticulate cu formaldehidă la o concentrație finală de 1% timp de 10 min la temperatura camerei și stinse cu o concentrație finală de 125 mm glicină timp de 5 min. Supernatantul a fost îndepărtat, iar celulele au fost omogenizate în 1 ml PBS pentru spălare. Celulele au fost alicotate pentru a conține 100 de milioane de celule, centrifugate, supernatantul a fost îndepărtat și peleta a fost înghețată.

o alicotă de 100 de milioane de celule (pentru utilizare în mai multe cipuri) a fost lizată în 500 unqql (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM Naci, 0.5% NP40 și inhibitor complet de protează (IPC, Roche)) prin incubare pe gheață timp de 10 min. Lizatul a fost microcentrificat la 2500 rpm Timp de 5 min la 4 centimetric C. supernatantul a fost îndepărtat, peleta a fost omogenizată în 1 ml (50 mM Tris-pH 8,0, 10 mm EDTA, 0,32% SDS și IPC) și incubată pe gheață timp de 10 min pentru a Liza nucleele. Proba a fost diluată cu 600 ilqql tampon de diluare a imunoprecipitării (tampon de diluare IP: 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mm EDTA, 150 mM NaCI, 1% Triton X-100 și IPC) până la o concentrație finală de (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 7 mm EDTA, 56 mM Naci, 0,4% Triton-X 100, 0.2% SDS și IPC) și sonicat cu un Bioruptor (Diagenode) timp de 10 cicluri cu intervale de pornire/oprire de 30 s pentru a obține fragmente de ADN de 100 până la 500 bp în dimensiune.

pregătirea țesuturilor de șoarece

țesuturile creierului, plămânului, ficatului și rinichilor de 16 săptămâni au fost furnizate cu generozitate de Dr.yanming Wang țesuturile de șoarece au fost procesate la 100 mg și cromatina a fost generată așa cum s-a descris anterior21 cu modificări minore. Pe scurt, 100 mg de țesut de șoarece au fost tocate în bucăți pe gheață, fixate cu 1% formaldehidă timp de 10 min și apoi stinse cu o concentrație finală de 125 mm glicină timp de 5 min. Celulele au fost filate, spălate cu PBS și apoi omogenizate în 1 mL de tampon rece de liză a celulelor Farnham (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 0,5% Triton X-100 și IPC). Celulele au fost apoi incubate pe un rototorque timp de 20 min la 4 C. nucleele izolate au fost izolate prin filare și resuspendate în tampon de liză nucleară RIPA (1% PBS, 1% NP-40, 0,5% Nadeoxicolat, 0,5% SDS și CPI). Nucleele au fost apoi sonicate cu un Bioruptor (Diagenode) timp de 10 cicluri cu intervale de pornire/oprire de 30 s pentru a genera ADN în intervalul de dimensiuni de 100-500 bp. Numărul de celule hepatice a fost estimat conform descrierii anterioare22, utilizând un factor de conversie de 1 mg greutate tisulară umedă egală cu ~250.000 de celule.

imunoprecipitarea cromatinei

un echivalent de cultură de 50 ml de drojdie sau 10 milioane de echivalent celular de k562 cromatină a fost diluat la 200 ilqutl cu tampon de diluare IP și incubat peste noapte la 4 ilcutc cu anticorpul adecvat. La probele de drojdie s-a adăugat un volum de 10 unqql de IgG-Dynabeads; la probele de K562 s-au adăugat și 3 centicg de anticorp anti-CTCF cu o suspensie echivalentă de 10 centicl de proteină a Mag Sepharose (GE Healthcare).

ChIP-exo 1.1

ChIP-exo 1.1 a fost efectuat conform descrierii anterioare7,8,23. Pe scurt, au fost efectuate următoarele etape enzimatice cu cromatină imunoprecipitată încă pe rășină cu spălări multiple de sare între fiecare etapă: Lustruirea finală a ADN polimerazei T4, polinucleotid kinaza T4, fragment Klenow a-decantare, ligatura adaptorului Read_2 mediată de ADN T4, completarea ADN polimerazei phi29, a doua polinucleotidă kinază T4, digestia exonucleazei lambda și digestia exonucleazei RecJf. După reticularea inversă peste noapte și tratamentul cu proteinază K, s-au efectuat următoarele etape în soluție: extensia primerului phi29, al doilea fragment Klenow a-decantare, ligarea adaptorului Read_1 mediată de ADN T4 și PCR.

ChIP-exo 3.0 și 3.1 (versiune bazată pe tagmentare)

după imunoprecipitare, au fost efectuate următoarele etape pe rășină. Pentru a asambla Transpozaza, Tn5 a fost incubat într-un amestec de Transpozază de 10 hectolitri conținând următoarele componente și incubat timp de 30 de minute la temperatura camerei: 12,5 October Tn5, 50% glicerol și adaptor de 7,5 October (NexA2/ME comp). Vezi Tabelul suplimentar 1 pentru secvențele de oligonucleotide utilizate în acest studiu.

Materialul cip pe rășină a fost spălat secvențial cu tampon de liză FA, tampon Naci (50 mm HEPES-KOH, pH 7,5, 500 mM NaCI, 2 mm EDTA, 1% Triton-X 100, 0.1% deoxicolat de sodiu), tampon LiCl (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mm LiCl, 1% NP-40, 1% deoxicolat de sodiu) și 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 la 4 ct.

reacția de etichetare (30 CT.) conținând: 20 mm Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10% dimetilformamidă și 1 amestecul de tagmentare de la etapa 1 (concentrație finală: 1,25 CTM TN5, 5% glicerol, adaptor 750 Nm) a fost incubat timp de 30 min la 37 C. după incubare, rășina a fost spălată de două ori cu tampon de guanidină-clorhidrat (50 mm tris-HCL, pH 7,5, 500 mm guanidină-clorhidrat, 2 mm EDTA, 1% Triton-x 100, 0.1% deoxicolat de sodiu) timp de 5 min la 37 °C, apoi o dată cu LiCl Tampon și 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 la 4 °C.

umplere în reacție (30 ml) conține: 10 U phi29 polimerazei (NEB), 1 × phi29 reacție tampon (NEB), 2 × (200 µg/ml) BSA, și 165 µM dNTPs fost incubate timp de 20 min la 30 °C, apoi se spală cu 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 la 4 °C. kinaza reacție (30 ml) conține: 10 U T4 PNK (NEB), 1 × T4 ADN-ul Ligase Tampon (NEB), și 2 × BSA a fost incubate timp de 15 min la 37 °C, apoi se spală cu 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 la 4 °C. λ exonuclease digestie (100 ml) contine: 20 U λ exonuclease (NEB), 1 × λ exonuclease reacție tampon (NEB), 0.1% Triton X-100, și 5% DMSO a fost incubate timp de 30 min la 37 °C, apoi se spală cu 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 la 4 °C. RecJf exonuclease digestie (100 ml) conține: 75 U RecJf exonuclease (NEB), 2 × NEBuffer 2, 0.1% Triton X-100, și 5% DMSO a fost incubate timp de 30 min la 37 °C; apoi se spală cu 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 la 4 °C.

ADN-ul a fost eluat din rășină, și invers cross-linking și Proteinaza K tratament au fost efectuate (40 µl) conțin: 30 µg Proteinaza K, 25 mM Tris-HCl, pH-ul 7.5, 2 mm EDTA, 200 mm NaCl și 0,5% SDS incubate timp de 16 ore la 65 C. supernatantul a fost apoi transferat într-un tub nou și purificat cu margele magnetice Ampure Agencourt (Beckman Coulter) urmând instrucțiunile producătorului și folosind volumul de ampure de 1,8 la sută adăugat la volumul ADN (72 la sută).Proba a fost eluată din perlele de Ampură în 10 ilqq de apă și s-au efectuat următoarele etape enzimatice în soluție.

ligatura adaptorului (versiunea 3.0): pentru reacția de extensie a grundului (volum total de reacție 20 unktil); la suspensia va fi omogenizată, eșantionul a fost adăugat 1 × phi29 reacție tampon, 2 × BSA, 100 µM dNTPs, și 0,5 µM-MI secvențe oligonucleotidice (total 9 µl) și incubate timp de 5 min la 95 °C, apoi 10 min la 45 °C pentru a permite oligo timp să se alipească. Eșantionul a fost mutat de la 30 °C înainte de a adăuga 10 U phi29 polimerazei (1 µl) și incubate timp de 20 min la 30 °C, apoi timp de 10 minute la 65 °C pentru a inactiva, și sa mutat la 37 °C.

Pentru A-decantare reacție (total reacție volum de 30 µl); pentru a amorsa extensia de reacție a fost adaugat 10 U Fragmentului Klenow, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, 100 µM dATP (total 10 µl) și incubate timp de 30 min la 37 °C, apoi timp de 20 minute la 75 °C pentru a inactiva, și sa mutat la 25 °C. Pentru cel de-al doilea adaptor de ligatura de reacție (total reacție volum de 40 µl); a-decantare reacție a fost adăugat de 2.000 U T4 ADN-ul ligase (enzymatics), 1 × NEBNext Rapid Ligatura Tampon (NEB), 375 nM adaptor (ExA1-58/13) și incubate timp de 1 h la 25 °C.

Atelă ligatura (versiunea 3.1): pentru adaptor ligatura (40 µl); la ADN-ul omogenizat s-au adăugat 1.200 u T4 ADN ligază, 1 tampon de ligază ADN T4 inkt, adaptor de 375 nM (ExA1-58/ExA1-SSL_N5) și incubat timp de 1 h la 25 inktc C.

ambele versiuni 3.0 și 3.1: reacția de ligare a fost apoi purificată cu granule de Ampură și omogenizată în 15 inktcl de apă. Eșantionul a fost apoi amplificat prin PCR. Pentru amplificarea PCR (volum total de reacție 40 ilft); la ADN-ul resuspendat s-au adăugat 2 U Phusion Hot Start polimerase (Thermo scientific), 1 ilft Phusion HF buffer (Thermo scientific), 200 ilft dNTP, 500 nM fiecare primer (P1.3 și NexA2-iNN) și amplificat timp de 18 cicluri (20 s la denatura 98 C, 1 min la recoacerea 52 C și 1 min La extensia 72 c). Un sfert din reacție a fost amplificat pentru încă șase cicluri (24 în total), iar prezența bibliotecilor a fost determinată prin electroforeză pe un gel de agaroză 2%.

selectarea mărimii: produsele PCR 200-500 bp au fost purificate cu gel dintr-un gel de agaroză 2% folosind kitul de extracție a gelului QIAquick (Qiagen).

ChIP-exo 4.0 și 4.1 (versiuni de ligare a ADN-ului cu o singură catenă)

după imunoprecipitare, au fost efectuate următoarele etape pe rășină. ChIP material de pe rășină fost spălate succesiv cu FA Tampon de Liză, NaCl Tampon, LiCl Tampon, și 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 la 4 °C. La sfârșitul de reparare reacție (50 µl) conțin: 7.5 U T4 ADN-polimerazei (NEB), 2.5 U ADN Polimeraza I (NEB), 25 U T4 PNK, 1 × T4 ADN-ul Ligase Tampon, și 390 µM dNTPs fost incubate timp de 30 min la 12 °C, apoi se spală cu 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 la 4 °C. λ exonuclease digestie (100 ml)conține: 20 U λ exonuclease, 1 × λ exonuclease reacție tampon, de 0,1% Triton X-100, și 5% DMSO a fost incubate timp de 30 min la 37 °C, apoi se spală cu 10 mM Tris-HCl, pH-ul 8.0 la 4 °C. RecJf exonuclease digestie (100 ml)conține: 75 U RecJf exonuclease, 2 × NEBuffer 2, 0.1% Triton X-100, și 5% DMSO vii și incubate timp de 30 min la 37 °C, apoi se spală cu 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 la 4 °C.

Primul adaptor ligatura: ssDNA ligatura (versiunea 4.0, 40 µl): pentru adapterion ligatura 1200 U T4 ADN-ul ligase, 1 × T4 ADN-ul Ligase Tampon, și 375 nM single-strand adaptor (ExA1-58-N5) a fost incubate timp de 1 h la 25 °C, apoi se spală cu 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 la 4 °C.

Atelă ligatura (versiunea 4.1, 40 µl): 1200 U T4 ADN-ul ligase, 1 × T4 ADN-ul Ligase Tampon, și 375 nM adaptor (ExA2.1-N5/ExA2.1-20) a fost incubate timp de 1 h la 25 °C, apoi se spală cu 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 la 4 °C.

Atât versiunea 4.0 și 4.1: ADN-ul a fost eluat din rășină, și invers cross-linking și Proteinaza K tratament au fost efectuate (40 µl) conțin: 30 µg Proteinaza K, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl, și 0,5% SDS incubate timp de 16 h la 65 °C.

supernatantul a fost apoi transferat într-un tub nou și purificat cu margele magnetice Ampure Agencourt (Beckman Coulter) urmând instrucțiunile producătorului (volum de 1,8 unq). Eșantionul a fost eluat din perlele de Ampură în 20 de centili de apă, iar următoarele etape enzimatice au fost efectuate în soluție.

al doilea adaptor ligation: ssDNA ligation (versiunea 4.0, volumul total de reacție 40 unqql): la ADN-ul omogenizat s-au adăugat 1200 u T4 ADN ligază, 1 tampon de ligază ADN T4 la un hectolitru, adaptor de 375 nM (ExA2.1-N5/ExA2.1-20) și s-a incubat timp de 1 h la 25 unqc.

ligaturarea adaptorului de atelă (versiunea 4.1, volumul total de reacție 40 ilct): la ADN-ul omogenizat s-au adăugat 1200 u T4 ADN ligază, 1 tampon de ligază de ADN T4 de la ilct, adaptor de 375 nM (ExA1-58/ExA1-SSL_N5) și s-a incubat timp de 1 oră la 25 ilcttct.

ambele versiuni 4.0 și 4.1: reacția de cu margele ampure (volum de 1,8 OQT) si omogenizate in 15 oqtl de apa. Eșantionul a fost apoi amplificat prin PCR. Pentru amplificarea PCR (volum total de reacție 40 ilqutl); la ADN-ul resuspendat s-au adăugat 2 U Phusion Hot Start polimerase (Thermo scientific), 1 FTF Phusion Hf Buffer (Thermo scientific), 200 dNTP-uri, 500 nM fiecare primer (P1.3 și NexA2-iNN) și amplificat timp de 18 cicluri (20 s la denatura 98 C, 1 min la recoacerea 52 C, 1 min La extensia 72 c). Un sfert din reacție a fost amplificat pentru încă șase cicluri (24 în total), iar prezența bibliotecilor a fost determinată prin electroforeză pe un gel de agaroză 2%. Selectarea mărimii: 200 până la 500 BP produsele PCR au fost purificate cu gel dintr-un gel de agaroză 2% folosind kitul de extracție a gelului QIAquick (Qiagen).

notă: ChIP-exo 4.0/4.1 a încorporat un adaptor universal Read_2, cu codul de bare adăugat mai târziu în timpul PCR cu grunduri lungi. Ori de câte ori primerii PCR lungi au fost utilizați într-o construcție de bibliotecă care a implicat digestia exonucleazei lambda, bibliotecile au suferit de randament scăzut și dimeri adaptori mari. Acum folosim doar adaptoare cu lungime completă și grunduri PCR cu lungime minimă.

ChIP-exo 5.0

după imunoprecipitare, au fost efectuate următoarele etape pe rășină. ChIP material de pe rășină fost spălate succesiv cu FA Tampon de Liză, NaCl Tampon, LiCl Tampon, și 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 la 4 °C. Pentru A-decantare reacție (50 µl) conțin: 15 U Fragmentului Klenow, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, și 100 µM dATP fost incubate timp de 30 min la 37 °C, apoi se spală cu 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 la 4 °C. primul adaptor ligatura și kinaza reacții (45 µl) conține: 1200 U T4 ADN-ul ligase, 10 U T4 PNK, 1 × NEBNext Rapid Ligatura Tampon, și 375 nM adaptor (ExA2_iNN / ExA2B) a fost incubate timp de 1 h la 25 °C, apoi se spală cu 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 la 4 °C. Umplere în reacție (40 ml) conține: 10 U phi29 polimeraza, 1 × phi29 reacție tampon, 2 × BSA, și 180 µM dNTPs fost incubate timp de 20 min la 30 °C, apoi se spală cu 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 la 4 °C. λ exonuclease digestie (50 µl) conține: 10 U λ exonuclease, 1 × λ exonuclease reacție tampon, de 0,1% Triton X-100, și 5% DMSO a fost incubate timp de 30 min la 37 °C; apoi se spală cu 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 la 4 °C.

ADN-ul a fost eluat din rășină, și invers cross-linking și Proteinaza K tratament au fost efectuate (40 µl) conțin: 30 mm proteinază K, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mm EDTA, 200 mM NaCl și 0,5% SDS incubate timp de 16 ore la 65 C. supernatantul a fost apoi transferat într-un tub nou și purificat cu margele magnetice Agencourt AMPure (Beckman Coulter) urmând instrucțiunile producătorului (volum de 1,8 mm).Eșantionul a fost eluat din perlele de Ampură în 20 de centili de apă, iar următoarele etape enzimatice au fost efectuate în soluție. Pentru a doua ligatura adaptor (volum total de reacție 40 oktil): la ADN-ul omogenizat s-au adăugat 1200 u T4 ADN ligază, 1 tampon de ligază ADN T4 int, adaptor de 375 nM (ExA1-58/ExA1-SSL_N5) și s-a incubat timp de 1 h la 25 int C. reacția de ligare a fost apoi purificată cu granule de Ampură (volum de 1,8 int) și omogenizată în 15 Int de apă.

eșantionul a fost apoi amplificat prin PCR. Pentru amplificarea PCR (volum total de reacție 40 unktl); la ADN-ul resuspendat s-au adăugat 2 U Phusion Hot Start polimerase (Thermo scientific), 1 FTF Phusion Hf Buffer (Thermo scientific), 200 dNTP-uri, 500 nM fiecare primer (P1.3 și P2.1) și amplificat timp de 18 cicluri (20 s la denatura 98 C, 1 min la recoacerea 52 C, 1 min La extensia 72 c). Un sfert din reacție a fost amplificat pentru încă șase cicluri (24 în total), iar prezența bibliotecilor a fost determinată prin electroforeză pe un gel de agaroză 2%. Selectarea mărimii: 200 până la 500 BP produsele PCR au fost purificate cu gel dintr-un gel de agaroză 2% folosind kitul de extracție a gelului QIAquick (Qiagen).

Notă: Am constatat că utilizarea unei alte metode decât purificarea gelului în această etapă duce la un nivel inacceptabil de ridicat al dimerilor adaptorului în proba finală. Purificarea gelului poate separa eficient dimerul adaptorului (fragment de 150 bp) și fragmente mai mici ale bibliotecii ChIP-exo (fragment de 200 bp = adaptoare de 150 bp + inserție de 50 bp).

secvențierea ADN

secvențierea ADN cu randament ridicat a fost efectuată cu un NextSeq 500 în modul pereche-end producând 2 lecturi de 40 BP de la XTX. Citirile secvenței au fost ulterior aliniate la genomul drojdiei (sacCer3) și uman (hg19) folosind BWA-mem (v0.7.9 a)24. Citirile aliniate au fost filtrate pentru a elimina aliniamentele non-unice și duplicatele PCR. Duplicatele PCR au fost definite ca secvențe de citire care posedă secvențe Read_1 și Read_2 identice.

disponibilitatea datelor

toate fișierele de secvențiere și fișierele de vârf din acest studiu sunt disponibile la NCBI Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) sub numerele de aderare GSE110681 și GSE114606. Fișierele de coordonate, parametrii scriptului și Codul personalizat utilizat pentru generarea cifrelor pentru această lucrare pot fi descărcate de la: https://github.com/CEGRcode/2018-Rossi_NatureCommunications.

toate celelalte date sunt disponibile de la autori la cerere rezonabilă.