testarea Chimerismului este utilizată pentru documentarea de rutină a grefării și urmăririi post-transplant a primitorilor de transplant alogen. Celulele donatoare și receptoare se pot distinge prin testarea markerilor genetici care sunt determinați înainte de transplant.2 în transplanturile nepotrivite de sex atunci când destinatarul și donatorul sunt de sex diferit, proporția celulelor feminine și masculine este de obicei determinată prin analiza markerilor cromozomilor sexuali, cel mai adesea cu pești.8,9 evaluarea numărului variabil de repetări în tandem (VNTR) sau repetări scurte în tandem (STR) prin PCR a devenit cea mai valoroasă metodă de determinare a chimerismului în transplanturile cu potrivire sexuală.Au fost dezvoltate 10 metode diferite pentru detectarea MRD. Analiza morfologică a măduvei poate identifica boala reziduală care ocupă mai mult de 5% din spațiul măduvei și, prin urmare, nu are sensibilitatea necesară pentru detectarea precoce. De asemenea, este adesea dificil să se diferențieze o mică populație de blasturi de leucemie de la blasturile hematopoietice normale derivate din donator care repopulează măduva fără a utiliza markeri suplimentari. Testele specifice pot detecta MRD atunci când există un marker tumoral specific, cum ar fi o anomalie citogenetică specifică, un imunofenotip specific care poate fi identificat prin FACS, secvențe specifice de ADN sau ARN care pot fi amplificate prin PCR sau un model specific de creștere în testele clonogene. În absența unui marker tumoral specific pentru MRD, testarea chimerismului poate fi utilizată pentru a detecta celulele derivate din destinatar. Detectarea celulelor derivate din receptor poate să nu se coreleze întotdeauna cu riscul de recidivă. Celulele receptoare care contribuie la chimerismul mixt (MC) aparțin clonei maligne sau pot fi celule hematopoietice normale sau chiar celule stromale. În primele câteva săptămâni după transplantul alogen standard, celulele receptoare pot fi încă detectate atunci când se utilizează teste sensibile.9,11 acestea sunt în mare parte celule T care supraviețuiesc regimului de condiționare. Celulele gazdă pot fi detectate la niveluri scăzute (<1%) chiar mai târziu în cursul post-transplant. MC este detectat mai des după condiționarea non-mieloablativă.2 astfel, sondele markerilor specifici tumorii sunt probabil superioare și mai precise decât sondele de nepotrivire a sexului pentru detectarea MRD.12 Cu toate acestea, chiar și detectarea MRD cu teste specifice tumorii nu poate fi întotdeauna corelată cu riscul de recidivă. Testele PCR pozitive pentru BCR / ABL au fost raportate la persoanele sănătoase.13 translocația t(14;18) a fost detectată în alte linii decât limfocitele B la pacienții cu limfom non-Hodgkin.14 poate exista un prag pentru ca MRD să fie semnificativ din punct de vedere clinic. În mai multe boli, cum ar fi AML cu t (8;21), 15 remisiuni de lungă durată au fost observate în prezența MRD detectată prin PCR, în timp ce în altele, cum ar fi în leucemia promielocitară acută, pozitivitatea PCR prezice recidiva.16 din nou, acest lucru poate fi legat de sensibilitatea testului PCR specific și de pragul La semnificația clinică. Celulele maligne reziduale pot fi într-o stare latentă17 fără potențialul de a contribui la recădere, din cauza lipsei sau câștigului unei a doua modificări genetice. În unele boli poate apărea o diferențiere parțială față de celulele mai mature și aceste celule pot să nu aibă potențialul de a prolifera. MRD poate fi sub supraveghere imună sau celulele MRD se află într-o fază apoptotică, făcându-le irelevante pentru recurența bolii. Testele PCR sensibile nu păstrează morfologia celulară și, prin urmare, nu este clar ce celule se corelează cu MRD în aceste setări diferite.
sistemul duet de analiză multiparametrică simultană morfologică și citogenetică combinată oferă câteva avantaje care pot ajuta la dezvăluirea relevanței detectării MRD. Acest sistem caută automat un număr mare de celule (aproximativ 150000 de celule pe diapozitiv) pentru subseturi celulare mici cu fenotip citogenetic sau imun unic. Sensibilitatea pentru detectarea populațiilor mici este crescută. Într-o serie de experimente de diluare am arătat că sensibilitatea pentru detectarea unei celule masculine într-o populație de celule feminine este mai mare de 1:50000, cu toate acestea, datorită specificității limitate în acest titru, cea mai bună detectare are loc între 1:10000 și 1:50000 (vezi apendicele). După cum s-a observat în analiza probelor de măduvă osoasă de la pacientul 1 (ultima analiză) și pacientul 2, Sistemul duet XV ar putea detecta populații foarte mici de celule receptoare XY care nu au fost detectate de peștii de rutină. Precizia cantitativă a peștilor depinde de frecvența observată și de numărul de celule marcate, astfel îmbunătățită prin punctarea mai multor celule.18 notarea unui număr atât de mare de celule nu este practică cu pește manual, dar sistemul automat duet XV este capabil să scaneze 10000 celule/min în microscopie cu câmp luminos și 2000-10000 celule/h în microscopie fluorescentă, susținând astfel nevoia de scanare rapidă și eficientă și sensibilitate crescută.
testele sensibile sunt adesea asociate cu specificitate redusă și o rată fals pozitivă relativ ridicată. În cazul peștilor standard, poate apărea un scor fals pozitiv datorită hibridizării nespecifice a sondei. Scor fals pozitiv pentru translocațiile cromozomiale poate apărea din cauza asocierii spațiale aleatorii și a fuziunii optice.18 sistemul duet XV poate îmbunătăți specificitatea prin identificarea morfologiei celulelor din populația căutată. Detectarea pozitivității peștilor, într-o populație mică, dar cu un aspect morfologic uniform duet, face mai probabil să fie un adevărat pozitiv, decât atunci când celulele pozitive sunt împrăștiate în linii diferite, fără legătură. Specificitatea detectării MRD cu testarea chimerismului nespecific poate fi, de asemenea, îmbunătățită. După cum sa discutat mai sus, celulele receptoare pot aparține clonei maligne (ca la pacientul 1), pot fi celule hematopoietice normale (pacientul 3, pacientul 1 după tratamentul cu STI571) sau celule non-hematopoietice/stromale (cum ar fi osteoblastele, pacientul 2). Sistemul duet XV permite diferențierea între aceste opțiuni prin aspectul morfologic. Am arătat în analiza pacientului 1 și a doi pacienți suplimentari (datele nu sunt prezentate), că identificarea caracteristicilor destinatarului (cum ar fi citogenetica de gen opus) în blasturi sau celule imature prezice recidiva evidentă și o precede cu câteva săptămâni până la câteva luni. La pacientul 1, analizele separate pentru pești au evidențiat o populație mică de primitori XY (0,6%) și o populație mică BCR/ABL pozitivă (0,8%) care ar putea fi luate în considerare în cadrul ratei fals pozitive a analizei pentru pești. Cu toate acestea, sistemul duet XV a arătat că o mare parte din celulele receptoare XY au fost explozii (și, de asemenea, BCR/ABL pozitive printr-un al doilea test FISH pe aceleași celule) și ar putea astfel să prezică că pacientul este destinat să recidiveze. Identificarea unei populații mici de primitori în celulele hematopoietice mature poate să nu prezică recidiva. La trei pacienți suplimentari (datele nu au fost prezentate) am documentat remisiunea continuă în prezența unei populații mici de primitori cu morfologie matură. Sunt necesare studii la scară mai mare, cu o urmărire mai lungă, pentru a confirma asocierea dintre morfologia celulelor gazdă reziduale și riscul de recădere la pacienții fără alți markeri unici pentru clona malignă.
sistemul este relativ simplu de operat, este în mare parte automat, timpul și costurile sale de ieșire sunt comparabile cu alte sisteme pentru himerism și detectarea MRD, cum ar fi FISH standard și PCR și poate fi potrivit pentru testarea la scară largă. În afară de hardware-ul și kiturile sistemului, este necesar doar echipamentul standard Disponibil în laboratoarele mari (a se vedea apendicele).
în ultimii ani, studiul chimerismului în cadrul diferitelor subseturi celulare a câștigat interes și popularitate.19,20 acest lucru este extrem de important după transplanturile non-mieloablative.2 Unele grupuri au demonstrat că himerismul complet în limfocitele T este necesar pentru inducerea GVL și, prin urmare, MC în acest subset celular poate fi asociat cu un risc crescut de recidivă, în special de malignități agresive, cu creștere rapidă.2,19 testarea Chimerismului subseturilor celulare necesită o sortare greoaie și consumatoare de timp a celulelor cu potențialul teoretic de a pierde unele celule în timpul acestui proces. Așa cum s-a discutat în apendice, pregătirea diapozitivelor pentru analiza duet XV nu determină pierderea sau reducerea niciunei populații celulare. Sistemul duet XV utilizează diapozitivul colorat MGG pentru a localiza limfocitele și alte subseturi celulare și poate utiliza, de asemenea, pete imunocitochimice (cum ar fi anticorpi monoclonali anti-CD3) pentru a localiza aceste celule. Într-o a doua fază, peștele poate fi aplicat pentru testarea chimerismului în transplanturi nepotrivite de sex. Prezentarea cazului pacientului 3 arată modul în care sistemul a fost utilizat pentru a urmări himerismul la un pacient după transplantul non-mieloablativ și modul în care conversia la himerismul complet după retragerea Ciclosporinei a prezis apariția răspunsurilor GVHD și GVT.
acest raport se concentreaza pe utilizarea duet in urma transplantului de maduva osoasa, cu toate acestea, pot exista multe alte implicatii. Sistemul poate ajuta, de asemenea, la studierea celulelor și descendențelor care adăpostesc un marker citogenetic sau imunofenotipic unic, cum ar fi fuziunea BCR/ABL (așa cum se vede la pacientul 1) și corelarea morfologiei lor cu riscul de recidivă după chimioterapia standard. Poate ajuta la dezvăluirea naturii MRD în diferite afecțiuni maligne și de ce detectarea MRD nu este întotdeauna predictivă a recidivei. În anumite setări pot fi căutate populații mici de celule donatoare sau micro-chimerism. De exemplu, microcimerismul sistemic limfo–hematopoietic detectat după transplantul de organe solide poate prezice toleranța la organul transplantat și poate direcționa terapia imunosupresoare.21 populația maternă mică care contaminează alogrefele de sânge din cordonul ombilical poate fi, de asemenea, detectată într-un mod similar și poate avea implicații asupra riscului post-transplant pentru GVHD.
în concluzie, prin adăugarea de analize morfologice ale populațiilor mici de celule cu malignitate sau markeri asociați receptorului, sistemul duet XV poate îmbunătăți acuratețea chimerismului și a testelor MRD și poate delimita semnificația clinică a acestora. Acest sistem merită un studiu suplimentar în studiile la scară mai mare.