în acest videoclip veți observa cum să efectuați testul de eliberare a cromului și să determinați potențialul citotoxic al celulelor efectoare.
celulele imune sunt responsabile pentru identificarea și eliminarea celulelor potențial dăunătoare, cum ar fi celulele canceroase sau infectate cu virus, din organism, care este o parte integrantă a răspunsului imun. Mai multe celule imune, cum ar fi celulele T și celulele NK, posedă o proprietate cunoscută sub numele de potențial citotoxic, care este capacitatea de a identifica celulele țintă și de a secreta proteine care induc degradarea proteinelor, Liza și moartea acestor celule țintă. Cuantificarea potențialului citotoxic este esențială pentru măsurarea activării și potenței celulelor imune, iar testul de eliberare a cromului este utilizat în mod obișnuit în acest scop.
această metodă permite utilizatorilor să compare citotoxicitatea indusă de anumite tipuri de celule imune în diferite condiții, ceea ce este valoros pentru studierea imunoterapiei împotriva cancerului și a bolilor legate de imunitate. Pentru început, celulele țintă, cum ar fi celulele canceroase, sunt incubate cu un izotop radioactiv, cromul 51, care este preluat de celule. Apoi, aceste celule etichetate radio sunt co-cultivate cu celulele imune izolate de interes, numite și celule efectoare, într – o placă cu fund rotund, cu 96 de puțuri, pentru a facilita interacțiunea dintre cele două tipuri de celule.
configurarea generală a testului implică incubarea unui număr specific de celule țintă cu concentrații diferite ale celulelor imune, împreună cu controale adecvate. Co-cultura permite celulelor efectoare să inducă apoptoza și Liza în celulele țintă, rezultând eliberarea cromului intracelular 51 în supernatant. Apoi, la un punct de timp preoptimizat, supernatantul care conține cromul eliberat este recoltat din toate puțurile. Cromul 51, fiind radioactiv, suferă spontan dezintegrare radioactivă pentru a emite radiații gamma. Nivelurile de radiații gamma din supernatanți din toate godeurile din placa de testare reprezintă o ieșire cuantificabilă a lizei celulelor țintă. Aceasta este măsurată folosind un contor gamma, care este apoi utilizat pentru a determina potențialul citotoxic al celulelor imune.
pentru început, celulele țintă, linia celulară de melanom uman WM793 în acest exemplu, sunt pregătite într-o singură suspensie celulară. Pentru a face acest lucru, îndepărtați mai întâi mediul din Balonul de cultură a țesuturilor și spălați celulele cu cinci mililitri de 1x PBS. Decantați PBS și apoi adăugați un mililitru de tripsină pe placă timp de aproximativ două minute. Loviți ușor balonul pentru a slăbi celulele de pe suprafața balonului și apoi adăugați cinci mililitri de mediu RPMI în balon. Pipetați mediul în sus și în jos pentru a colecta celulele și adăugați această suspensie într-un tub conic de 15 mililitri.
introduceți tubul în centrifugă timp de cinci minute la 1200 RPM. Apoi, scoateți suportul din tub, asigurându-vă că nu perturbați peleta celulară. Împingeți ușor partea inferioară a tubului pentru a perturba peleta celulară și adăugați 10 mililitri de mediu în tub. Apoi, pipetați ușor suportul în sus și în jos pentru a aduce celulele în suspensie. Apoi, determinați concentrația celulară utilizând un hemocitometru și transferați doi mililitri din suspensia celulară originală într-un nou tub conic de 15 mililitri. Așezați tubul într-o centrifugă și peleți celulele la 12 sute RPM timp de cinci minute. După centrifugare, turnați excesul de mediu din tub într-un recipient pentru deșeuri. Vârtejați scurt tubul pentru a omogeniza peleta celulară în volumul mic de mediu lăsat în urmă.
apoi, pregătiți-vă să utilizați Chromium 51 mutându-vă într-un spațiu de laborator dedicat acestei radioactivități. Ar trebui să existe o ecranare amplă a plumbului pentru depozitarea și utilizarea în siguranță a cromului 51 în toate etapele, precum și o semnalizare adecvată pentru a indica unde sunt păstrate probele cu crom 51. Un contor Geiger echipat cu o sondă de clătite este, de asemenea, necesar pentru a servi în spațiu pentru o posibilă contaminare.
Odată configurat pentru utilizarea corectă a radioactivității, adăugați 100 de microcuri de crom 51 direct în suspensia celulei țintă. Apoi, adăugați o mică bucată de bandă radioactivă la tub pentru a indica faptul că proba și tubul sunt acum radioactive. Așezați tubul într-un incubator de 37 de grade celsius cu un scut de plumb și incubați timp de o oră, apăsând tubul la fiecare 15 până la 20 de minute.
în timp ce celulele țintă etichetează, pregătiți o suspensie unică de celule efectoare. În acest exemplu, celulele nucleare mono din sângele periferic uman sau Pdmc-urile au fost izolate din sângele integral prin centrifugarea gradientului de densitate standard la o concentrație de 5 ori 10 până la A 6-a. Transferați această suspensie de celule efectoare într-un rezervor de reactiv de unică folosință și apoi adăugați 200 microlitri din această suspensie în fiecare godeu din rândul B într-o placă cu fund rotund cu 96 de godeuri. Apoi, adăugați 100 microlitri de RPMI la fiecare godeu din rândul C până la G al plăcii.
acum, începeți să efectuați diluții seriale ale Pbmc-urilor pentru a avea o serie de numere de celule efectoare, eliminând mai întâi 100 microlitri ai celulelor din godeurile din rândul B și adăugând acest lucru la rândul C. apoi, diluați în continuare celulele efectoare transferând 100 microlitri de celule din rândul C în rândul D. continuați diluția serială. Odată ce rândul G este atins, mutați 100 de microlitri din godeuri pentru a lăsa un volum final de 100 de microlitri în fiecare godeu din rândul respectiv. Apoi, adăugați 100 microlitri de mediu de cultură tisulară în godeurile din rândul a pentru a servi drept control pentru eliberarea spontană a cromului 51 din celulele țintă, deoarece nu trebuie adăugate celule efectoare la acest rând. Apoi, așezați o placă într-un incubator de 37 de grade celsius până când celulele țintă sunt gata să fie adăugate.
după perioada de incubație, scoateți celulele țintă din incubator și spălați cu 5 mililitri de FBS pentru a îndepărta orice exces de crom 51. Apoi, așezați tubul într-o centrifugă desemnată și rotiți la 1200 rpm timp de 5 minute. Îndepărtați spălarea FBS radioactivă într-un recipient adecvat pentru deșeuri și repetați etapa de spălare prin omogenizarea peletei în 5 mililitri proaspeți de FBS. Așezați tubul într-o centrifugă desemnată și rotiți din nou celulele la 1200 rpm timp de 5 minute. Îndepărtați cea de-a doua spălare și verificați radioactivitatea încorporată a peletei folosind un contor Geiger. În cele din urmă, omogenizați peleta în 10 mililitri de mediu complet și turnați suspensia de celule țintă marcată cu crom 51 într-un rezervor de reactiv de unică folosință. Apoi, adăugați 100 de microlitri din aceste celule țintă etichetate în fiecare puț al plăcii celulare efectoare de 96 de puțuri. Apoi, adăugați 100 microlitri de 1% NP-40 în apă la godeurile din rândul H pentru a Liza toate celulele țintă în fiecare rând. Aceste sonde vor fi folosite ca un control pentru a determina numărul total pe minut, sau cpm.
acum că placa este pregătită, fixați capacul adăugând o bucată mică de bandă pe fiecare parte a plăcii și așezați o bucată de bandă radioactivă pe capac pentru a indica faptul că conține crom 51. Apoi, așezați placa într-o centrifugă marcată pentru a manipula probele radioactive. Dacă se utilizează o singură placă experimentală, adăugați o placă de echilibru la centrifugă. Setați centrifuga la 1200 rpm și aduceți placa la viteză. Odată ajuns la viteză, opriți mașina. Scoateți placa din centrifugă. Apoi, așezați placa într-un incubator de 37 de grade celsius cu o bucată mică de ecranare cu plumb peste placă pentru o siguranță suplimentară. Incubați timp de 16 ore pentru a permite celulelor țintă să se lizeze.
la sfârșitul perioadei de incubație, îndepărtați cu atenție banda din jurul marginii plăcii și scoateți capacul. Apoi, așezați cadrul de recoltare pe placă, asigurându-vă că discurile mici de filtrare sunt la locul lor pentru fiecare dintre dopurile de bumbac. Acum, apăsați încet și ușor dopurile de bumbac în puțuri. După aproximativ zece secunde, eliberați presiunea pe dopurile de bumbac, apoi transferați dopurile de bumbac în benzi de tub. Așezați fiecare dintre aceste tuburi într-un tub FACS secundar. În cele din urmă, încărcați tuburile FACS pe un contor gamma și rulați probele pentru a cuantifica cantitatea de crom 51 eliberată în fiecare condiție. Înregistrați cu atenție ordinea în care tuburile au fost încărcate în tejghea.
aici, pbmc-urile nestimulate au fost adăugate la primele 3 benzi și Pmbc-urile stimulate CPG au fost adăugate la benzile 4 până la 6. În acest exemplu, numărul pe minut a fost introdus în celulele unei foi de calcul în același mod în care probele au fost prezentate în placa originală și au fost calculate mediile triplicatelor. De exemplu, pentru prima condiție, celulele A1, A2 și A3 au fost medii în celula I3. Odată ce mediile sunt determinate, procentul de liză specifică pentru fiecare condiție poate fi calculat folosind această formulă. De exemplu, pentru a calcula procentul de liză specifică pentru celulele nestimulate care au avut un raport de 50 la 1 celule efectoare la celulele țintă, CPM spontan, care în acest exemplu este 1164,67, a fost scăzut din CPM experimental, 1129. 67. Acest număr poate fi apoi împărțit la diferența dintre CPM maxim și CPM spontan și apoi înmulțit cu 100 pentru a da procentul de liză specifică. Aceasta este apoi calculată pentru fiecare condiție. Aceste date pot fi apoi grafice pentru a arăta compararea raportului E la T cu procentul de liză specifică atât pentru Pbmc-urile nestimulate, cât și pentru PBMC-urile stimulate de CPG. În acest exemplu, celulele efectoare stimulate cu CPG au ucis mai eficient celulele țintă pe măsură ce raportul dintre celulele efectoare și celulele țintă a crescut. Această creștere nu a fost observată în Pbmc nestimulate, indicând faptul că stimularea CPG este necesară pentru creșterea observată a lizei celulelor țintă.