Rolul semnalelor chordin / Bmp în dezvoltarea faringiană a mamiferelor și sindromul | dezvoltarea DiGeorge

rezultate

defecte de gastrulare la șoarecii Chrd -/ –

proteina de legare BMP secretată de Chrd este exprimată în nodul șoarece și derivații săi, notocord și endoderm faringian(Fig. 1A-F). Proteina Chrd conține patru domenii bogate în cisteină (CR), toate capabile să lege BMP-urile.CR1 și CR3 prezintă cea mai mare afinitate pentru Bmp4 și pot antagoniza semnalele Bmppe injectarea ARNm în embrioni Xenopus(Larrain și colab., 2000). Pentru a genera o alelă nulă de Chrd, am pregătit o construcție de direcționare cu codoni de oprire a traducerii în cele trei cadre posibile de citire din regiunea peptidelor semnalale. Codonii stop au fost urmați de o schimbare a cadrului și de introducerea, după CR1, a casetelor IRES-lacZ și PGK-neo care au întrerupt în continuare gena Chrd (Fig.1G). Transcrierile din această alelă Chrdtm1DR(denumită în continuare Chrd-) au fost embrioni incrd-/- nedetectabili în stadiul nodului (Fig. 1J, vârf de săgeată).

șoarecii heterozigoți Chrd au fost viabili și fertili și au fost împerecheați cu embrioni Chrd-/- generați de diferite forme de dezvoltare stages.At ziua E8.5, am observat prezența nodulilor de resorbție în uterul femelelor însărcinate și o mică reducere a numărului așteptat de embrioni CRD -/ – (50 recuperați, 57 așteptați). Patru embrioni mutanți homozigoți genotipați au arătat o reducere clară a mărimii regiunii embrionare, însoțită de o mărire a alantoisului cu privire la restul embrionului (Fig.2A, A’). În secțiunile histologice, o hipoplazie considerabilăa plăcii neuronale (Fig.2B, B’), absența somiților și a notocordului (Fig. 2C, C’) și anabundența celulelor mezodermice extra-embrionare în alantois (Fig. 2D, D’) au fost observate. Restul mutanților (46) au fost indistinguizabili morfologicde la colegii lor heterozigoți și sălbatici. Fenotipul mutanților fourabnormali a fost similar, dar mai puțin pronunțat decât ventralizarea mezodermului observată la Chrd dublu homozigot;Nogmutanți (Bachiller și colab., 2000) în care, în plus, au fost prezente și trunchieri anterioare ale plăcii neurale.

în zebrafish și Xenopus, inactivarea Chrd determină anexpansiunea mezodermului ventral și reducerea mezodermului dorsal și a neuralplate (Schulte-Merker și colab.,1997). La mamifere, mezodermul se formează în timpul gastrulării priningpresia celulelor epiblast prin dunga primitivă. Celulele care ies lacapătul posterior al dungii primitive se deplasează în regiunea extra-embrionară, unde dau naștere unei linii mezodermice (alantois, amnion și insule de sânge ale sacului gălbenușului) echivalent cu mezodermul ventral alxenopus. În schimb, celulele situate în mai multe regiuni anterioare alestreak rămân în interiorul embrionului propriu-zis și produc mezodermul plăcii paraxiale, intermediare și laterale ale trunchiului viitor. Fenotipul timpuriu al CRD – / – mutanților, în care alantoisul este extins la consumul mezodermului embrionar, este în concordanță cu o ventralizare timpurie a embrionului de șoarece. Acest fenotip trebuie să ducă la moartea animalelor afectateanimale, deoarece niciun mutant homozigot cu alantois anormal nu a fost recuperat de ladisecții în etapele ulterioare. Analiza acestui fenotip cu markeri molecularinu a fost efectuată deoarece s-au obținut atât de puțini embrioni anormali.

letalitate perinatală

doar 49% (95 din 194) din Chrd-/-animalele așteptate au fost recuperate la naștere, toate prezentând același fenotip complet penetrant. Dintre acestea, majoritatea au fost născuți morți,dar câțiva au încercat, fără succes, să-și umfle plămânii. În exterior, neonații mutanți homozigoți au fost puțin mai mici decât colegii lor de gunoi de tip sălbatic și au prezentat cianoză,microcefalie și reducerea urechii externe, care a fost stabilită anormal de aproapela ochi (Fig. 3A’).Examen histologic (Fig.3B ‘-C’) a relevat lipsa timusului (t, un derivat al celei de-a treia pungi faringiene) și a Palatului secundar (p) și hipoplazia urechii interne (ie) în mutanți. Lobul anterior și pars intermedia glandei pituitare(pi), ambele derivate din ectodermul Oral dorsal imediat adiacent marginii cefalice a endodermului anterior, au fost normale (Fig. 3C, C’). Aceasta a definit limita rostrală a fenotipului în orofaringe, cu deformări limitate la derivații endodermului de exprimare a Chrd. Glanda tiroidă, care se formează în endodermul faringian ventral la foramen cecum, s-a diferențiat, dar a fost hipoplazică și de formă neregulată(th, Fig. 3C’). Glandele paratiroide, derivați ai pungilor faringiene 3 și 4, au fost absente(datele nu au fost prezentate), o observație în concordanță cu hipocalcemia neonatalăvăzut la persoanele cu sindrom DiGeorge(DiGeorge, 1968). Concluzionămcă fenotipul șoarecilor Chrd – / – morți recapituleazămajoritatea caracteristicilor descrise la astfel de indivizi.

defecte scheletice

în preparatele scheletice ale animalelor nou-născute,oasele apendiculare și lombare au fost normale, dar baza craniului șischeletul axial anterior a prezentat defecte multiple. Modificările osului temporal au inclus lipsa squama temporalis (st) și scurtarea arcului zigomatic (Fig.4A, A’). De asemenea, s-a observat o hipoplazie considerabilă a osului hioid și a cartilajelor tiroidiene și laringiene cricoide(Fig. 4B’) și maxilarul anabormal mic (Fig.4C’). La baza craniului, alisfenoidul (as)a apărut normal, dar în linia mediană oasele basioccipital (bo) și basisfenoid(bs) au fost topite, iar presfenoidul (ps) a fost hipoplastic(Fig. 4D, D’). Consistentcu constatările histologice, rafturile palatine nu au reușit să se extindă medial pentru a forma Palatul secundar. În ureche, inelul timpanic și capsula oticăau fost reduse și malformate (Fig.4D’). Malformații scheletice au fost, de asemenea, observate la nivelul colului uterinși regiunile toracice ale coloanei vertebrale. Corpurile vertebrale(vb) au fost mai mici la Chrd-/- nou-născuți (Fig. 4E’), cu întârziereossificarea și pierderea ocazională a altor elemente ale vertebrelor, cum ar fi procesele spinoase, arcurile neuronale și arcul anterior al atlasului(Fig. 4e ‘ șifig. 5A’).

defectele scheletice ale mutanților Chrd au fost deja detectabile condensări incartilage la E14 .5 (Fig.5A, A’). Cartilajele bazioccipitale și bazisfenoide au fost fuzionate, iar Centrul de osificare al bazioccipitalului a fost mai îngust și extins în bazisfenoid (Fig.5B, B’). Notocordul anterior, care a fost prezent înmijlocul basioccipitalului de tip sălbatic, a fost absent în mutanții Chrd (Fig. 5B, B’). Absența notocordului anterior a fost confirmată prin examinarea histologică a regiunii cervicale la E14 .5 (Fig.5F’).

oasele afectate de mutația Chrd au foarte diferiteorigine. Bazioccipitalul este pur de origine somitică; părți ale bazisfenoidului apar din osificarea endocondrală a mezenchimului cefalic; Palatina provine din osificarea intramembranoasă a mezenchimului derivat din creasta neuronală; capsulele otice se diferențiază de un amestec de mezodermă paraxială și celule de creastă neuronală; iar hioidul este derivat strict de creastă neuronală(le Douarin și Kalcheim,1999). Pe fondul unei astfel de diversități de linii, principiul unificator al fenotipului pare a fi localizarea structurilor malformate în apropierea mezendodermului axial care exprimă Chrd(Fig. 1E). Această interpretare este în concordanță cu degenerarea prematură observată a notocordului anterior la animalele Chrd – / – și cu cerința plăcii prechordale și a semnalelor derivate din mezendoderm pentru dezvoltarea scheletului capului (Belo și colab., 1998; Couly și colab., 2002; David și colab.,2002).

defecte cardiovasculare asemănătoare DiGeorge

cianoza observată la naștere poate fi un semn de defecțiune cardiacă. Pentru a investiga acest lucru în continuare, au fost efectuate disecții în diferite stadii ale dezvoltării embrionare. La E14.5, inimile animalelor CRD – / – au arătat un singur vas, în loc de două normale, în tractul de ieșire cardiacă(Fig. 5D, D’, E, E’).Această afecțiune este cunoscută la om sub numele de persistent truncus arteriosus și este o malformație animortantă la persoanele cu sindrom DiGeorge. Lipsa separării dintre aorta ascendentă și trunchiul pulmonar poate crește sarcina de lucru a ventriculului drept, determinând hipertrofia acestuia, precum și vasodilatația, edemul și hemoragia observate la embrionii E14.5(Fig. 5C’). Ca sindrom inDiGeorge, defectele sistemului cardiovascular s-au extins dincolo de tractul de ieșire și au inclus marile vase derivate din arharterele faringiene (Fig. 6). La mutanții nou-născuți, arterele carotide comune s-au alăturat direct truncusarteriosului, rezultând absența arterei brahiocefalice și a unei părți a arcului aortic (Fig. 6A-C).Arterele pulmonare au provenit direct din truncusarteriosul proximal, rezultând absența unui trunchi pulmonar comun(Fig. 6A-C). În plus, au fost observate defecte de lateralitate, cu o întoarcere anormală la dreapta a aortei 40% din mutanți (Fig. 6, comparați 6Cu 6F). Când s-au efectuat disecții din spate, s-a putut observa că, în funcție de lateralitatea aortei descendente, arterele subclaviene drepte sau stângi au adoptat o poziție retroesofagiană anormală (Fig. 6D-F). Efecte similare au fost descrise la embrionii de pui cu ablații ale celulelor crestei neuronale (Kirby și colab., 1983) și înmice care transportă ștergeri în regiunea congenică DiGeorge(Lindsay și colab., 1999;Merscher și colab., 2001) ormutații în Tbx1 și Fgf8(Abu-Issa și colab., 2002; Frank și colab., 2002;Jerome și Papaioannou, 2001; Lindsay și colab., 2001; Vitelli și colab., 2002b).

la naștere, doar 49% Din mutanții homozigoți Chrd așteptați au fostacoperite. Cu toate acestea, 48 Din cei 56 (86%) embrioni Chrd-/-așteptați erau încă în viață în așternuturi disecate la E14.5, o frecvență care nu diferă semnificativ de cea observată la E8.5 (88%). Creșterea ascuțităîn letalitate după E14.5 coincide cu manifestarea completă a fenotipului cardiovascular și sugerează că disfuncția circulatorie este o cauză importantă a letalității embrionilor Chrd-/- în timpul gestației târzii.

anomalii faringiene

pentru a determina debutul fenotipului faringian am disecat femeile însărcinate de la împerecheri heterozigote la momente diferite post coitum. La E9.0, astage la care Chrd este exprimat în endodermul faringian, embrionii Chrd-/- ar putea fi identificați printr-o indentare în regiunea gâtului (Fig.7A’, săgeată). Veziculele otice ale mutanților au fost redusela jumătate din diametrul lor normal (Fig.7A’, vârfuri de săgeată) și al doilea arc faringian (hioid) a fostdorând. Arcurile faringiene de la trei la șase nu s-au format niciodată în embrioni mutanți(Fig. 7B ‘ și datele nu sunt prezentate). Structurile lipsă sau malformate sunt fie precursori direcți, fie joacă roluri inductive în timpul dezvoltării multor organe care sunt defecte la naștere la șoareci Chrd -/ -. Deoarece majoritatea anomaliilor fenotipice observate la mutanții nou-născuți au originea lor embriologică în endodermul faringian și în regiunea perifaringiană, am analizat expresia unui număr de gene cunoscute a avea roluri importante de dezvoltare în boala ereditară umană.

am examinat mai întâi expresia Pax3, un factor de transcripțieexprimat în creasta neurală, tubul neural dorsal și somiții(Goulding și colab., 1991). Inumani, PAX3 este mutant în bolile creastei neuronale desemnatesindromul Waardenburg tipurile 1 și 3(Strachan și Read, 1994) șieste un co-regulator, împreună cu SOX10, al microftalmie ormitf genă (Bondurand și colab., 2000), factorul de transcripție mutat în sindromul Waardenburgtipul 2a la om (Tassabehji și colab.,1994). Mutația Pax3 la șoarece (Sp2H) are ca rezultat defecte cardiace, inclusivpersistent truncus arteriosus, precum și malformații ale timusului, tiroideiși glandele paratiroide (Conway și colab.,1997). Am constatat că expresia Pax3 a fostindistinguizabilă între embrionii de tip mutant și sălbatic la E7.5 (nu este prezentată),dar la E10.5 au fost observate diferențe semnificative. Celulele crestei PAX3-pozitiveneurale care migrează prin arcadele faringiene 3, 4 și 6(Fig. 7C, vârfuri de săgeată) au fost aproape detectabile la animalele Chrd -/ – (Fig. 7C’). Aceste celule neuralcrest populează septul care separă aorta de artera pulmonarăîn tractul de ieșire sau regiunea conotruncală a inimii (Li și colab., 2000). Eșecul crestei neuronale cardiace de a ajunge la inimă explică lipsa de absorbție a tractului de ieșire și fenotipul cardiovascular ulterior observat în mutanții IRD. Interesant este că expresia Pax3 în alte țesuturi, cum ar fica componenta mandibulară(md) a primului arc faringian, dermomiotomii (dm) și precursorii mioblastelor din membrele anterioare(fl) nu a fost afectată (Fig. 7C’).

în continuare, am efectuat hibridizări in situ cu Sox10, un genemutat la persoanele cu sindrom Waardenburg de tip 4(Pingault și colab., 1998) careeste exprimată în celulele neuronale crest și Schwann. La E7.5, expresia ox10 a fost aceeași în embrionii Chrd-/- și în colegii lor de gunoi de tip sălbatic (datele nu sunt prezentate). La E9.5, Sox10expresia în ganglionii rădăcinii dorsale (drg) a trunchiului a fost normală(Fig. 7B, B’), dar distribuția celulelor gliale care exprimă Sox10 a relevat deficiențe specifice în organizarea sistemului nervos periferic în regiunea gâtului și capului mutanților (Fig.7B’). În special, ganglionii senzoriali cranieni au fost marcațiabnormalități. Ganglionii trigemeni (tr) și vestibulo-cohleari (vc), corespunzători nervilor cranieni V și VIII, au fost localizațimai aproape împreună în embrionii Chrd-/- decât în colegii de tip sălbatic. În plus, au fost observate proiecții nervoase anormale care leagă cele două (Fig. 7B’, vârf de săgeată). Ganglionii geniculați (g), petrosal (p) și nodoză (n), corespunzători nervilor cranieni VII, IX și X, au fost cei mai afectați, arătândfie o reducere extremă a dimensiunii, fie o absență completă. Aceste trei ganglioni provin din placodele epibranchiale și se știe că necesită semnale inductive de la endodermul anterior pentru dezvoltarea lor corectă(Begbie și colab., 1999). Lipsa ganglionilor derivați de placod epibranchial indică faptul că proteina secretată este necesară pentru activitatea semnalului inductiv eliberat de endodermul faringian.

Pax9 este un factor de transcripție necesar pentru dezvoltarea endodermului faringian și a derivaților săi la șoarece(Peters și Balling, 1999;Peters și colab., 1998). La E9.5, expresia Pax9 în endodermul faringian al embrionilor CRD – / -a fost mai slabă decât în colegii lor de tip sălbatic (pe, Fig.7D, D’). Expresia Pax9 a arătat că dimensiunea șiforma faringelui a fost modificată în mutanții Chrd, cu pete faringiene reduse la o singură umflare în regiunea cea mai anterioară(Fig. 7E, E’). Hipoplazia faringelui a fost confirmată de secțiunile histologice ale E14.5embrios, în care endodermul anterior a apărut ca un tub subțire care conturează un lumen diminuat (ph, Fig.5F, F’). Reducerea endodermului faringian a fost, de asemeneaobservată în knockdown-urile Xenopus Chrd(Oelgeschl Inktsger și colab.,2003). Regiunile non-faringiene în care este ARNm Pax9exprimat în mod normal, cum ar fi sclerotomii somitici (sc) și mezenchimul facial(fm), nu au prezentat diferențe în distribuția sau abundența transcrierilor (Fig.7F, F’).

concluzionăm din aceste studii că modificările expresiei Pax3, Sox10 și pax9 sunt limitate la o zonă foarte limitată de domenii de Expresie mai largă, sugerând că lipsa proteinei secretate chrdspecific perturbă căile locale de reglementare care acționează în regiunea perifaringiană din jurul endodermului care exprimă Chrd.

expresia Tbx1 și fgf8 necesită chordin

pentru a studia interacțiunea Chrd cu genele cunoscute de a cauzadigeorge sau fenotipuri asemănătoare DiGeorge la șoareci, am analizat expresia tcbx1 și Fgf8 în embrionii mutanți Chrd. Tbx1este membru al familiei de factori de transcripție T-box(Papaioannou și Silver,1998). Se mapează în cadrul microdeletiei DGS/VCFS 22q11 la omși s-a dovedit recent că provoacă fenotip asemănător DiGeorge la inactivarea șoarecilor (Jerome și Papaioannou,2001; Lindsay și colab., 2001; Merscher și colab., 2001; Vitelli și colab.,2002a). Expresia Tbx1 a fost modificată înhrd – / – embrioni. La animalele de tip sălbatic E7.5, Tbx1este exprimată în foregut (viitor endoderm faringian) și mezoderm de cap(Fig. 8A). În această etapă,colegii de gunoi mutanți au arătat o reducere clară a nivelurilor de Expresie Tbx1 în aceleași zone (Fig.8A’). Reducerea ARNm Tbx1 a fost la fel de clară în regiunea faringiană a embrionilor homozigoți Chrd la E8.0, E8.5 și E9.0 (Fig.8B’, C’, D’). Secțiuni histologice transversea arătat că la nivel celular abundența transcrierilor Tbx1a fost redusă drastic în endoderm, atât în faringe, cât și până lanivelul diverticulului hepatic (Fig.8f-H’) scăderea concentrației de ARNm Tbx1a fost evidentă și în mezoderm, inclusiv în cap, splanchnic (vârfuri de săgeată) și mezoderm(săgeți) în regiunea perifaringiană (Fig.8F’, G’, H’). În plus, expresia Tbx1 la E9 în miezul mezodermic al primului arc faringian a fost difuză, extinzându-se la cea mai mare parte a arcului, iar transcrierile Tbx1 au fost absente din vezicula otică (Fig.8D-D’).

Fgf8 este un factor de creștere secretat exprimat într-o varietate dețesuturi, inclusiv endodermul faringian și mezodermul vecin(Crossley și Martin, 1995;MacArthur și colab., 1995).În timpul dezvoltării timpurii, Fgf8 este necesar pentru gastrulare (Sun și colab., 1999) șistabilirea axei de simetrie stânga/dreapta(Meyers și Martin, 1999). Etapele Atlater ale Fgf8 sunt necesare pentru membre (Lewandoski și colab., 2000;Luna și Capecchi, 2000) șicraniofacial (Trumpp și colab., 1999) dezvoltare. Experimentele recente au arătat că șoarecii cuactivitatea redusă a Fgf8 prezintă un spectru de defecte cardiovasculare și faringiene care imită îndeaproape sindromul DiGeorge(Abu-Issa și colab., 2002; Frank și colab., 2002). În plus, expresia Fgf8 este abolită în endodermul faringian ofTbx1 – / – mutanți și ambele gene interacționează genetic în timpuldiferențierea arterelor arcului faringian (Vitelli și colab., 2002b). AtE9, expresia Fgf8 în mutanții Chrd este normală în Istmul creierului mijlociu, proeminența frontonasală și coada. Cu toate acestea, în faringianendoderm, nivelurile de transcriere Fgf8 sunt reduse drastic(Fig. 8E’). Reducerea expresiei Tbx1 și Fgf8 în embrionii Chrd – / – a sugerat că ambele gene acționează în aval de Chrd în aceeași cale de reglementare. Aceste experimente nu determină dacă Chrdeste necesar pentru întreținerea sau pentru inducerea Tbx1 și fgf8 în faringe și țesuturile vecine.

pentru a testa dacă Chrd poate induce Tbx1 și Fgf8, am injectat ARNm Chrd (50 pg) în regiunea ventrală a embrionilor xenopus în stadiul cu patru celule. Zona marginală ventrală (VMZ)explantele au fost disecate la gastrula timpurie, cultivate până când embrionii frați au ajuns la stadiul neurulei timpurii și analizate de RTPCR. ARNm-urile Tbx1 șifgf8 au fost exprimate la niveluri ridicate la embrioni întregi și la explantele zonei dorsalmarginale (DMZ) în acest stadiu și la niveluri scăzute la explantele VMZ(Fig. 8i, benzile 1-3). Uponmicroinjecție, ARNm Chrd a crescut nivelurile de Tbx1 și fgf8 în VMZ (Fig. 8I, banda 4). Hibridizarea in situ a embrionilor Xenopus microinjectați a confirmat că transcrierile Tbx1 induse de MRN Chrd au fost localizate în endodermul faringian (datele nu sunt prezentate). Concluzionăm căhrd, un antagonist Bmp, poate induce expresia Tbx1 și Fgf8 în embrionii Xenopus și este necesară pentru exprimarea completă a acestor gene în regiunea faringiană a embrionului de șoarece.