testul de Imunoprecipitare a cromatinei (ChIP) este o metodă importantă pentru monitorizarea reglării transcripționale cu cunoștințe neacoperite despre interacțiunile dintre proteinele specifice și o regiune genomică a ADN-ului. Având în vedere faptul că proteinele care leagă ADN-ul (inclusiv factorii de transcripție și histonele) din celulele vii pot fi reticulate cu ADN-ul pe care îl leagă, ChIP este utilizat pentru a imunoprecipita complexul proteină–ADN din lizați celulari printr-un anticorp adecvat. Complexele imunoprecipitate sunt colectate prin centrifugare, iar proteinele sunt eluate pentru analize suplimentare, cum ar fi western blot și LC/MS.analiza acidului Nucleic se realizează prin PCR, RT-PCR, secvențierea ADNc și microarray. Acest protocol oferă o procedură detaliată pentru a obține un test de cip de succes într-un mod rapid și eficient.
reactivi:
- 37% formaldehidă
- 1 m glicină
- tampon de liză celulară: 150 mm NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mm EDTA, 0,5% NP-40, 1% Triton X-100, cu 1 cocktail de inhibitor de protează de la sută.
- PBS: pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4.
- 10% Chelex 100
Equipments:
- Sonicator
- Ultrasonic bath
- Rocking or shaking device
- Eppendorf tube rotator
- Refrigerated microcentrifuge
- Gel electrophoresis apparatus
- PCR apparatus
Steps:
Cross-link and cell collection
1. Se adaugă 27 unktil 37% formaldehidă per 1 mL mediu de cultură pentru a obține o concentrație finală la 1%, se incubează celulele timp de 10 minute la temperatura camerei în timp ce se agită încet pe un dispozitiv de balansare sau agitare.
2. Se potolește legătura încrucișată prin adăugarea a 141 ilqutl 1 m glicină pe 1 mL mediu de cultură pentru a obține o concentrație finală la 125 mM, se incubează celulele timp de 5 min la temperatura camerei.
3. Pentru celulele plutitoare: se introduc celule într-un tub conic de 15 mL, se centrifughează la 2.000 XTX g la 4 XTX C timp de 5 min. Aruncați supernatantul și spălați celulele de două ori cu PBS rece.
treceți la Pasul 5.
4. Pentru celulele adezive: îndepărtați mediul, spălați celulele de două ori cu PBS rece. Răzuiți celulele în PBS într-un tub conic de 15 mL, centrifugați la 2.000 XTX g la 4 XTX C timp de 5 min.
Liza și Sonicare
5. Se aruncă supernatantul, se adaugă 1 mL tampon de liză a celulelor reci la 1 107 celule. Omogenizați peleta prin pipetare în sus și în jos de mai multe ori și incubați pe gheață timp de 10 minute.
6. Sonicat pentru a forfeca cromatina în fragment de 0,5~1 kb. Evitați spuma și păstrați proba pe gheață.
Note:
- condițiile de Sonicare ar trebui optimizate în funcție de modelul de probă și sonicator. De obicei, s-a constatat că șase impulsuri de 15 secunde urmate de perioade de repaus de 45 de secunde la ieșirea 6.0 funcționează. Pentru analiza dimensiunii fragmentului, extrageți un volum mic de ADN total dintr-un alicot de cromatină forfecată și apoi analizați pe un gel de agaroză (1~2%).
- se recomandă ca volumele să fie de 1 ml pentru a menține eficiența sonicării.
7. Se centrifughează la 12.000 centimetric g la 4 centimetric C timp de 10 min și se reține supernatantul.
8. Se transferă 0,5 mL supernatant într-un 1 proaspăt.Tub de 5 mL pentru analiza fragmentelor ADN.
Imunoprecipitare
9. Adăugați anticorpi relevanți sau IgG normal la probă și incubați timp de 15 minute într-o baie de apă cu ultrasunete la temperatura camerei.
Note:
- alegeți IgG din aceeași specie în care au fost produși anticorpii.
- timpul de incubație trebuie optimizat în funcție de anticorp și antigen. Pentru antigeni cu un nivel scăzut de exprimare, incubația ar putea fi efectuată la 4 centimetric C peste noapte pe o platformă rotativă .
10. Pregătiți margele de proteine a-agaroză: se spală mărgelele de trei ori cu 1 mL tampon de liză (fără inhibitor de protează), se centrifughează la 2000 de grame pentru câteva secunde la 4 de grame și apoi se aruncă supernatantul.
11. Se diluează mărgelele 1: 1 cu tampon de liză și se adaugă 50 de centicli la probă.
12. Se incubează la 4 centimetric C timp de 30~45 min într-o platformă rotativă.
13. Se centrifughează la 2000 centimetric g timp de 1 min la 4 centimetric C și apoi se aruncă supernatantul.
14. Spălați bilele de patru ori cu 1 mL tampon de liză (fără inhibitor de protează), aruncați supernatantul.
purificarea și analiza ADN
15. Omogenizați perlele spălate cu 100 XQL 10% Chelex 100.
16. Pipetați în sus și în jos timp de câteva secunde, apoi fierbeți proba timp de 10 minute.
17. Se centrifughează la 12.000 centimetri g timp de 1 min la temperatura camerei și se transferă supernatantul într-un tub proaspăt de 1,5 mL.
18. Purificați ADN-ul folosind un kit de purificare a ADN-ului sau prin protocolul standard de extracție fenol: cloroform.
19. Se dizolvă ADN-ul cu 50 unktil ddh2o, și de a folosi 2~10 unktil din proba de ADN (25% din volumul de reacție) în reacțiile PCR
Aflați mai multe despre principiul cip
ajunge la nostru cip servise
dacă aveți orice întrebare, vă rugăm să ne contactați la: