plante și agentul patogen
planta comună de gheață (Mesembryanthemum crystallinum L.) a fost cultivată într-o seră așa cum este descris de Ku inktivniak și colab. . După apariția celei de-a 3-A perechi de frunze, un set de plante a fost irigat cu 0,4 M NaCl pentru a induce metabolismul acidului Crassulacean (plante CAM), în timp ce altul a fost irigat în continuare cu apă de la robinet (plante C3). După 12 zile, inducerea CAM în plantele tratate cu NaCl a fost confirmată prin măsurarea valorii diurne a malatului în seva celulelor frunzei. Ulterior, frunzele perechilor de frunze a 2-a de plante C3 și CAM au fost inoculate cu Botrytis cinerea în conformitate cu Ku Inktifniak și colab. .
clorofilă o imagistică fluorescentă
Mini versiunea unui Fluorometru cu clorofilă imagistică-Pam seria M (Walz, Effeltrich, Germania) echipat cu un suport pentru frunze a fost utilizată pentru a înregistra imagistica cu fluorescență (Fluorometru cu clorofilă din seria imagistică-Pam m) . Fluorometrul este un model de agrafă pentru aplicații pe teren. Suportul pentru frunze se asigură că frunza este ținută orizontal față de sursa de lumină pentru a evita iluminarea eterogenă pe diferite zone ale probei de frunze. Pozițiile de eșantionare au fost alese pentru a fi distanțate în mod egal de-a lungul midribului, cu toate acestea au diferit ușor pentru orice frunză datorită dimensiunii și morfologiei sale și tehnicii de plasare a frunzelor în suport. Pentru a identifica doar efectele stresului biotic și pentru a evita introducerea de artefacte în procedura de măsurare a fluorescenței clorofilei, pe frunze nu s-au aplicat semne de referință care să permită Referirea imaginii frunzelor. Fluorescența clorofilei din frunzele obișnuite de plante de gheață a fost obținută prin definirea zonei de interese (instrumentul Aoi) folosind software-ul Imaging Win 2.41 A.
cu Imaging-PAM, randamentul curent de fluorescență (Ft) a fost monitorizat continuu. Plantele au fost adaptate la întuneric timp de 20 de minute. La aplicarea unui impuls de saturație, s-au determinat randamentul fluorescenței la nivel întunecat (Ft = F0) și randamentul maxim de fluorescență (Fm). Randamentul cuantic maxim PSII, Fv / Fm și randamentele cuantice ale disipării energiei reglementate și nereglementate în PSII, Y(NPQ) și Y(NO) au fost imaginate. Fv / Fm a fost calculat conform ecuației: Fv/Fm = (Fm − F0) Fm. Y (NPQ) a fost calculat în conformitate cu Kramer și colab. prin formula: 1-Y (II) − 1/(NPQ + 1 + qL (Fm/F0-1)). Y (nu) a fost calculat în conformitate cu Kramer și colab. prin ecuația: Y (Nu) = 1/. Procesul de imagistică oferă imagini pseudo-Color (modul color indexat) ale materialului biologic cu o rezoluție de 640 XTX 480 pixeli corespunzătoare câmpului vizual al dimensiunilor fizice de 32 XTX 24 mm.
frunzele infectate ale plantelor C3 și CAM au fost prelevate pentru chl o analiză de fluorescență la momentul inoculării și 3, 6, 9, 24, 32, 48, 54 și 72 de ore după inoculare. Chl o fluorescență a fost măsurată pentru frunzele atașate ale celei de-a 2-a perechi de frunze de la trei plante C3 și CAM provenind din două repetări independente ale cultivării plantelor. Fiecare frunză luată pentru analiză a fost examinată separat în toate punctele de timp (Fig. 1). Serii reprezentative de nouă imagini(una pentru fiecare punct de timp) ale Y(NO), Y (NPQ) și FV/Fm pentru plantele de gheață C3 și CAM au fost procesate pentru a măsura modificările acestor parametri într-o zonă selectată a lamei frunzelor ecranate în timp. Pentru comparație, datele medii Y(NO), Y(NPQ) și Fv/Fm din întreaga regiune a frunzelor descrise în Fig. 2 au fost obținute. Rezultatele alinierii imaginii și măsurarea patteringului spațiotemporal al propagării stresului biotic în frunze cu metoda propusă au fost exemplificate pe imaginile Y(NO).
Exemple de imagini ale randamentului cuantic al disipării energiei nereglementate în frunzele comune ale plantelor de gheață. Se aplică PSII Y (NO) a parametrilor de fluorescență C3 (a–d) și CAM (e–h). Fragmentul frunzei conține locul inoculării agentului patogen și simptomele propagării stresului
exemplu de imagine a frunzei comune de plante de gheață C3 cu regiuni selectate de interes. Selecțiile realizate manual în editorul de firmware acoperă zonele infectate (1), fără simptome (2), precum și zonele midrib (3)
alinierea imaginii
mecanismul de colectare a datelor imaginii PAM în secvența de timp are ca rezultat deplasarea fragmentului de frunză în câmpul vizual între punctele de timp individuale (Fig. 1). Datorită schimbării poziției frunzelor, caracteristici precum midribul și locurile de inoculare au atât locație, cât și orientare diferită. Mai mult, se poate observa efectul rescalării. Pentru a evalua corect propagarea stresului, câmpurile de vizualizare ar trebui sincronizate reciproc, presupunând că una dintre ele este o imagine de referință (fixă), iar restul imaginilor să fie aliniate cu cea fixă. Această abordare este cunoscută în imagistica medicală sub numele de înregistrare a imaginilor . Sarcina de bază de înregistrare pentru imaginile fluorescente este de a găsi transformarea ‘similaritate’ constând în rotație corespunzătoare, traducere și scalare. Îndoirea suprafeței frunzelor și plierea frunzelor de stres apar numai în regiunile locale de imagini unice și au o importanță minoră pentru alinierea imaginii globale. Acestea pot fi compensate în etapa postprocesării înregistrării prin transformări neliniare, cum ar fi, de exemplu, plăci subțiri, spline de suprafață și mapări demon .
imaginile fluorescente sunt luate ca o serie de fotografii în intervale de timp predefinite de aproximativ aceeași regiune a frunzei. Elementele caracteristice ale stivei considerate de imagini reprezintă în principal vene de frunze. Cu toate acestea, ele se disting slab de conținutul imaginii datorită contrastului limitat, precum și a modului de culoare al imaginii PAM. Zonele simptomelor de stres care domină vizual conținutul se pot schimba între imagini într-o singură serie. Într-o astfel de situație înregistrarea automată ar eșua.
cele mai populare metode automate de ultimă generație se bazează pe compararea intensității imaginii cu unele valori de corelație (metode bazate pe intensitate) sau se bazează pe căutarea în imaginile fixe și în mișcare a corespondenței dintre caracteristicile imaginii selectate, cum ar fi puncte, linii și contururi (metode bazate pe caracteristici) . Niciuna dintre aceste abordări nu permite înregistrarea corectă a imaginilor de fluorescență PAM ale plantei de gheață comune, ceea ce a fost verificat și prezentat în exemplele incluse în materialele suplimentare (fișierul suplimentar 1). Rezultatele prezentate acolo confirmă faptul că motivul înregistrărilor automate nereușite este întunecarea puternică a regiunilor de imagine cu caracteristici conservate prin modificări dinamice ale conținutului imaginii cauzate de infecția țesutului frunzelor. Testele metodelor populare au fost efectuate atât de Estimatorul de înregistrare în Matlab, cât și în mediul Fiji .
algoritmul de înregistrare a imaginii PAM a fost proiectat în mediul Matlab pe baza setului de puncte de control selectate manual de un expert. Pentru a seta punctele de control corespunzătoare în fiecare imagine a fost aplicată funcția cpselect de Control Point Selection Tool din Image Processing Toolbox. Imaginile au fost editate în perechi, inclusiv o imagine fixă și o imagine în mișcare. Prima imagine obținută imediat după inocularea agentului patogen a fost asumată ca o imagine fixă (de referință). Prin cartografierea interactivă a punctelor, utilizatorul poate indica nu numai contururile vizibile ale nervilor, ci și alte elemente caracteristice, cum ar fi punctul de injecție, locurile de-a lungul propagării agentului patogen, precum și cele mai evidente celule ale vezicii epidermice (Fig. 3).
puncte de Control selectate de expert. Exemplul y (Nu) imagini ale unui fragment de frunză al unei plante comune de gheață cu came: o imagine fixă (de referință), B imaginea în mișcare care trebuie aliniată cu cea fixă
mai multe perechi de locații ale punctelor de control, distribuite cât mai larg posibil pe suprafața imaginii frunzei, sunt suficiente pentru a alinia corect imaginile aceleiași frunze considerate aproximativ ca un corp rigid. Distribuția mai largă a punctelor de control îmbunătățește sensibilitatea potrivirii imaginii, dar este limitată de câmpul de vizualizare a imaginii decupat după transformarea alinierii și de posibilitatea localizării precise a punctului selectat pe lama frunzei. Cu o astfel de aliniere a imaginii, transformarea afină a fost efectuată utilizând funcția fitgeotrans inclusă în Image Processing Toolbox. Această transformare a fost limitată la versiunea ‘similaritate’ (constând doar din traducere, rotație și similitudine), deoarece scena din fluorometrul PAM a apărut ca nefiind înclinată. Imaginile în mișcare au fost potrivite cu imaginea fixă folosind funcția imwarp. Ilustrația grafică a algoritmului de înregistrare este inclusă în Fig. 4.
diagrama bloc a înregistrării afine și opționale B-spline aplicate imaginilor Pam fluorescente. \(\left\) – vectorul punctelor de control din imaginea fixă, \(\left^{\left (k \right)}\) – vectorul punctelor de control din imaginea în mișcare k, \(\left^{{\left ({k^{\prime } } \ right)}}\) – vectorul punctelor de control din imaginea în mișcare k după înregistrarea B-spline
frunzele aflate în diferite stadii de infecție pot avea o suprafață local ondulată sau încrețită, ca în regiunea marcată în imaginile Pam-fluorometru analizate (Fig. 5a, b), care formă poate influența potențial analiza corectă a fenomenului de propagare a agentului patogen. Înseamnă că metoda de înregistrare afină bazată pe transformarea geometrică poate să nu fie suficientă pentru a se potrivi cu imaginile Pam de fluorescență în unele cazuri de frunze cu deformare neliniară aparent vizibilă. Prin urmare, autorii propun o metodă de înregistrare în două etape în care înregistrarea rigidă afină este urmată de înregistrarea B-spline reducând deformările neliniare.
exemplu de înregistrări afine și B-spline pentru C3 imagine comună frunze de plante de gheață. a Imaginea Y (NO) după obținerea PAM, B imaginea după transformarea afină rigidă cu săgețile reprezentând vectori de deplasare setați interactiv utilizați în a doua etapă de înregistrare și C forma finală după înregistrarea B-spline bazată pe punctul de control
selectarea tipului de înregistrare non-rigid exploatează faptul că frunzele obișnuite ale plantelor de gheață reprezintă un material puțin flexibil, iar forțele mici de îndoire mențin modificări netede într-un profil al suprafeței frunzelor. Specificitatea acestei modificări de înregistrare este că vectorii câmpului de deformare a imaginii trebuie să fie impuse interactiv. În acest scop, un editor de câmp vectorial dedicat a fost atașat algoritmului. Doar câțiva vectori de deplasare din imaginea în mișcare trebuie specificați pentru a înregistra deformări locale și netede ale unei suprafețe de frunze ca în Fig. 5B.
algoritmul B-spline Rueckert a fost selectat pentru a doua etapă a înregistrării. Implementarea sa este disponibilă în Matlab Central File Exchange ca Dirk-Jan Kroon Spline Registration Toolbox .
procedura de înregistrare B-spline constă în două etape de bază:
-
inițializarea unei grile G de puncte de imagine distribuite uniform pe suprafața imaginii cu toți vectorii câmpului de deformare setați la zero și apoi calculând un câmp vectorial dens T de deformări în grila G prin interpolarea cubică B-spline a vectorilor de deplasare a punctului de control setați manual \(\left^{\left( k \right)}\). Atât grila, cât și câmpul de transformare asociat t sunt apoi rafinate iterativ în 4 pași pentru a reduce spațierea nodului grilei. Transformarea T este pregătită de funcția point_registration din Spline Registration Toolbox.
-
B-transformarea spline a tuturor pozițiilor pixelilor și interpolările bi-cubice ale componentelor de culoare din imaginea mobilă (înregistrată afină) \(I_{M}\) în funcție de câmpul de deformare netezit spline.
precizia înregistrării imaginii
precizia alinierii imaginii propuse a fost realizată de pătratul mediu rădăcină (RMS) pe abateri de N = 15 puncte de control prezentate în Fig. 3. Deplasarea fiecărui punct fix de control al imaginii \(p_{i}\) evaluat într-o imagine în mișcare pentru cazul cu și fără aliniere a fost ilustrată în Fig. 6 ca vectori \(R_{i} P_{i} =\Delta R_{i}\) și \(Q_{i} P_{i} =\Delta q_{i}\) respectiv. Erorile de deplasare RMS ale tuturor punctelor de control dintr-o singură imagine pentru cele două cazuri sunt exprimate în Eq. (1) ca \(\Delta r_{\text{rms}}\) și \(\Delta q_{\text{rms}}\).
ilustrarea evaluării erorilor în înregistrarea afină a imaginilor PAM. \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots ,N\)—punct de control în imaginea fixă \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—maparea punctului de control \(P_{i}\) în imaginea în mișcare \(I_{m}\), \(R_{i}\)—maparea punctului de control \(P_{\text{i}}\) după înregistrare, \(R_{i} p_{i} =\Delta R_{i}\)—eroare de deplasare a punctului de control \(p_{\text{I}}\) după înregistrare
procentul de deplasare reziduală \(\delta_{RMS}\) după înregistrarea tipului afin, poate fi evaluat pe o imagine conform Eq. (2).
erorile de înregistrare afină evaluate sunt enumerate în tabelul 1. Deplasările originale\(\Delta q_ {\text{rms}}\) variind de la 3,01 la 7,09 mm sunt reduse după înregistrarea ‘similarității’ la intervalul de la 0,45 la 1,71 mm de\(\Delta R_ {\text{RMS}}\) pentru instalația C3 testată. Aceiași parametri pentru CAM plant sunt \(1.90 \ div 5.69\; {\text{mm}}\) pentru \(\Delta q_{\text{rms}}\) și \(0.41 \div 1.53\;{\text{mm}}\) pentru \(\Delta R_{\text{rms}}\). Când \(\delta_{RMS}\) este mediată atât pentru seria de imagini C3, cât și pentru seria de imagini CAM, aceasta este egală cu aproximativ 21%, respectiv 23%. Valorile parametrilor de fluorescență Y (NO), Fv/Fm și NPQ obținute din imaginile frunzelor plantelor de gheață fără înregistrare sunt preluate din părți incompatibile ale frunzei și nu pot fi luate în considerare (a se vedea fișierul suplimentar 2).
Pentru maparea suplimentară a înregistrării B-spline, eroarea de transformare este definită de două componente. Prima dintre ele este deplasarea post-înregistrare \(\Delta R_{i} = R_{i} P_{i}\) prezentată în Fig. 7a, cu\ (R_{i}\) evaluat în Eq. (3) ca centroid \(\bar{p}\) a regiunii \(a_{i}\).
unde \(I_{R} \stânga (p \dreapta) \în\ stânga\) denotă intensitatea imaginii punctului de control înregistrat la pixelul p, \(\stânga| {a_{i}}\dreapta|\)—zona regiunii neclare. A doua componentă de eroare este definită de raza deviației standard \(\rho_{i}\) a intensității răspândite în jurul fiecărui punct de control \(R_{i}\) așa cum este descris în Eq. (4).
unde\ (\stânga \|\ cdot\ dreapta\|\) denotă norma euclidiană a vectorului dintre punctele p și\ (\bar{p}\) din planul imaginii. Estomparea punctului de control aliniat \(R_{i}\) apare datorită faptului că înregistrarea neliniară folosește interpolarea Bicubică în grila de rezoluție finită G. acest efect a fost măsurat experimental prin efectuarea unei transformări B-spline date în imaginea construită din puncte de control albe pe un fundal negru. Tabelul 2 include magnitudinile \ (\Delta q_{i}\) ale N = 9 exemplu vectori de câmp de deplasare prezentat în Fig. 5b. Magnitudinile \ (\Delta R_{i}\) ale erorilor de mapare vectorială după înregistrarea splinei sunt măsurate între punctele de control fixe dorite \(P_{i}\) și centroizii punctelor înregistrate \(R_{i}\) evaluate în regiunea \(a_{i}\). Toate valorile testate \ (\Delta R_{i}\) sunt sub rezoluția pixelilor egală cu \(50\;\upmu{\text{m}}\) și pot fi neglijate—rotunjite la 0. Aceasta înseamnă poziționarea precisă a punctelor de control de către transformata spline. Deviația standard \(\rho_{i}\) a regiunii de estompare prezentată în tabelul 2 după dublare poate fi o măsură a neclarității punctului de control. Apoi variază aproximativ de la \(24\; {\text{la}}\; 63\; \ upmu {\text{m}}\) care este echivalentul neclarității unui pixel. Astfel, această transformare permite restabilirea locală a formei corespunzătoare a modificărilor Y (NO) într-o imagine de fluorescență.
explicarea erorii în înregistrarea imaginii B-spline a imaginilor PAM. a nepotrivirea de cartografiere locație punct de control în timpul înregistrării, B distribuția intensității imaginii de spline punct de control înregistrat, \(p_{i} ,\;i = 1, \ldots ,N\)—punct de control în imaginea fixă \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—echivalentul punctului de control \(P_{i}\) în imaginea în mișcare \(I_{m}\), \(R_{i}\)—maparea punctului de control \(P_{i}\) după înregistrare, \(R_{i} p_{i} =\Delta R_{i}\)—măsurarea erorii de deplasare a mapării punctului de control \(I_{i}\) p_{i}\),\(a_{i}\)—regiune neclară în jurul\ (R_{i}\) corespunzătoare punctului de control\ (p_{i}\), \(\rho_{i}\)—raza de abatere standard a\ (R_ {i}\) blur
măsurarea propagării stresului
analiza datelor aplică un instrument special de editor pentru manipularea unui teanc de imagini PAM după înregistrarea lor. Funcția editor principal permite desenarea a două secțiuni de linie de achiziție de date \(l_{1} \;{\text{și}}\;l_{2}\) de lungime egală (Fig. 8), care pot fi observate și disponibile pe orice imagine din stivă. În experimentul considerat prima linie \(l_{1}\) începe la locul inoculării \(s_{1}\), unde factorul de stres este aplicat țesutului frunzei la momentul t și ar trebui să fie aproximativ setat în direcția expansiunii stresului. A doua linie \(l_{2}\) este plasată de-a lungul midribului unde influența stresului observată în timp a fost întotdeauna limitată și parametrii de fluorescență prezintă modificări minime. Liniile ar trebui să se potrivească în întregime în contextul imaginii.
regiuni de măsurare în Y (Nu) imagini ale frunzelor comune ale plantei de gheață după alinierea computerului. Punctele de măsurare indică: (1) mezofilă la locul inoculării, (2) mezofilă fără leziuni, (3) midrib în apropierea locului de inoculare. Linia de măsurare (L1) este orientată în direcția propagării stresului în mezofilă, iar linia (L2) este situată de-a lungul midribului. Liniile începute la punctele (S1) și (S2), respectiv
opțiunea suplimentară de măsurare punctuală este posibilă atunci când trei mici regiuni circulare diferite ale razei de 10 pixeli sunt plasate interactiv în câmpul vizual (Fig. 8). Acestea ar trebui să aparțină regiunilor frunzelor cu parametri de fluorescență diferiți în timp. Toate valorile pixelilor înregistrați sunt medii în interiorul acestor regiuni.