rezultate și discuții
în ziua inoculării, pH-ul dextrozei agar sterile de cartof (PDA) a fost de 5,63, în timp ce pH-ul PDA tamponat steril a variat între 3,51 și 9,35. După patru săptămâni de incubare la temperatura camerei (25 C), pH-ul agarului steril a scăzut (până la 0,19) pentru PDA tamponat, Tris tamponat și Tris-maleat tamponat și a crescut (până la 0,24) pe PDA tamponat citrat-fosfat și carbonat-bicarbonat tamponat (Tabelul 1).
Tabelul 1.
măsurători ale pH-ului agarului steril de dextroză din cartofi.
| Mediu | pH-ul prezis al tamponului | pHa real | |
|---|---|---|---|
| agar steril | |||
| Ziua 0 | ziua 28 | ||
| PDA netamponată | n / a | 5.63 | 5.47 |
| Tris tamponat PDA | 7.20 | 6.61 | 6.50 |
| 8.00 | 7.61 | 7.59 | |
| 9.00 | 8.24 | 8.19 | |
| PDA tamponat cu citrat-fosfat | 3.00 | 3.51 | 3.69 |
| 4.00 | 4.28 | 4.49 | |
| 5.00 | 5.17 | 5.40 | |
| 6.00 | 6.07 | 6.31 | |
| 7.00 | 7.01 | 7.23 | |
| PDA tamponat cu carbonat-bicarbonat | 9.20 | 9.07 | 9.13 |
| 10.00 | 9.25 | 9.26 | |
| 10.70 | 9.35 | 9.39 | |
| Tris-maleat tamponat PDA | 5.20 | 5.21 | 5.02 |
| 6.00 | 5.84 | 5.75 | |
| 7.00 | 6.53 | 6.45 | |
| 8.00 | 7.37 | 7.30 | |
| 8.60 | 7.91 | 7.83 | |
este prezentată o medie de trei probe.
coloniile pe PDA neumplute (pH 5,63) au ajuns la 60 mm în diametru după patru săptămâni. Când pH-ul PDA a fost crescut cu tamponul Tris (pH 6,61, 7,61 și 8,24), dimensiunile medii ale coloniilor au fost mai mari comparativ cu cele ale PDA neumplute (Figurile 1 și and2A).2A). Perithecia au fost prezente pe PDA netamponată și toate Tris tamponate mass-media de patru săptămâni. Ascosporii au fost observați după patru săptămâni pe PDA netamponat și Tris tamponat PDA la pH 6,61 și 7,61, dar nu la pH 8,24. Nu s-au observat ascospori până la opt săptămâni post-inoculare pe PDA tamponat Tris la pH 8,24 (Tabelul 2).
Compararea diametrelor coloniei C. globosum pe Agar de dextroză de cartof tamponat și neumplut. PH-ul real al fiecărui mediu în ziua inoculării este listat pe axa X. Diametrele coloniilor au fost măsurate în fiecare săptămână. Diametrul maxim al fiecărei plăci a fost de 83 mm.sunt afișate eroarea medie și standard a mediei (n = 15 plăci).
fotografii ale coloniilor C. globosum la 4 săptămâni pe agar de dextroză de cartof tamponat și neumplut Tris (a), pe Agar de dextroză de cartof tamponat cu citrat-fosfat (b) și pe Agar de dextroză de cartof tamponat cu Tris-maleat (c). Centrul fiecărei plăci de agar a fost inoculat cu 500 de spori C. globosum suspendați în 20 de centili de apă. Aceste fotografii descriu părțile frontale și inverse ale plăcilor de agar cu colonii C. globosum după patru săptămâni de incubație la temperatura camerei.
Tabel 2
efectul pH-ului asupra sporulării.
| Mediu | pH-ul prezis de tampon | rezultatele diapozitiv bandă | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| prezența periteciei | prezența ascosporilor | ||||||
| Săptămâna 4 | Săptămâna 6 | săptămâna 8 | Săptămâna 4 | Săptămâna 6 | săptămâna 8 | ||
| PDA netamponată | n / a | + | + | + | + | + | + |
| Tris tamponat PDA | 7.2 | + | + | + | + | + | + |
| 8.0 | + | + | + | + | + | + | |
| 9.0 | + | + | + | − | − | − | |
| Citrate-phosphate buffered PDA | 3.0 | − | NT | NT | − | NT | NT |
| 4.0 | − | + | + | − | − | + | |
| 5.0 | − | + | + | − | − | + | |
| 6.0 | − | − | + | − | − | − | |
| 7.0 | − | + | + | − | − | + | |
| PDA tamponat cu carbonat-bicarbonat | 9.2 | − | − | − | − | − | − |
| 10.0 | − | − | − | − | − | − | |
| 10.7 | − | − | − | − | − | − | |
| Tris-maleat tamponat PDA | 5.2 | − | − | − | + | + | + |
| 6.0 | + | + | + | + | + | + | |
| 7.0 | + | + | + | + | + | + | |
| 8.0 | + | + | + | − | + | + | |
| 8.6 | + | + | + | + | + | + | |
o bandă de diapozitive au fost luate dintr-o singură placă de agar la patru, șase sau opt săptămâni post-inoculare. Prezența sau absența periteciei și ascosporilor este indicată cu un „+” sau „−” respectiv. Probele care nu sunt prelevate sunt indicate prin „NT”.
un tampon fosfat citrat a fost utilizat pentru a obține PDA variind în pHs de la 3,51 la 7,01 (Tabelul 1). Coloniile cultivate la un pH de 7,01 au acoperit întreaga placă (83 mm în diametru) la patru săptămâni după inoculare (figura 2b). Pe măsură ce pH-ul a scăzut pe fiecare mediu, dimensiunile coloniilor au scăzut. După patru săptămâni, coloniile au crescut la un pH de 3.51 a atins doar o medie de 11 mm în diametru (Figura 1) și nu s-au observat filamente hifale pe lamele de bandă (datele nu sunt prezentate). La un pH de 4,28, 5,17, 6,07 și 7,01, nu s-au produs peritecii la patru săptămâni post-inoculare, dar în cele din urmă au format opt săptămâni post-inoculare. După opt săptămâni, ascosporii au fost prezenți la un pH de 4,28, 5,17 și 7,01 (Tabelul 2).
tamponul carbonat-bicarbonat a ridicat pH-ul PDA mai mare decât tamponul Tris (pH 9,07, 9,25 și 9,35) (Tabelul 1). Dimensiunea medie a coloniei pe fiecare mediu tamponat carbonat-bicarbonat a fost mai mică comparativ cu PDA tamponat citrat-fosfat la un pH de 7,01 (Figura 1). Nu s-au observat peritecii sau ascospori la 4, 6 sau 8 săptămâni post-inoculare (Tabelul 2).
tamponul Tris-maleat a avut ca rezultat valori ale pH-ului PDA cuprinse între 5,21 și 7,91 (Tabelul 1). După două săptămâni, cele mai mari colonii au fost observate la cel mai mic pH. la trei și patru săptămâni, coloniile cu cel mai mare diametru au fost pe PDA cu un pH de 7,37 și 7,91 (Figurile 1 și and2C).2C). La patru săptămâni, numeroase ascospori au fost observate la un pH de 5.21 și 5,84, în timp ce puține sau deloc ascospori au fost observate pe celelalte PDA tamponate cu Tris-maleat (datele nu sunt prezentate). În termen de șase săptămâni, ascosporii au fost produși pe fiecare mediu (Tabelul 2).
per total, cele mai mari colonii au fost obținute la un pH neutru (7,01) (Figura 1). Cu două săptămâni, aceste colonii erau semnificativ mai mari în comparație cu orice alt mediu. Cu patru săptămâni, dimensiunea medie a coloniei pentru fiecare mediu a fost semnificativ mai mică, cu excepția unui pH de 6,07, 7,37, 7,61 și 7,91, comparativ cu un pH de 7,01 (datele nu sunt prezentate). Numărul total de spori pentru fiecare grup a fost determinat așa cum s-a descris anterior . Niveluri detectabile de ascospori au fost observate pe următoarele trei din șaptesprezece medii la patru săptămâni post-inoculare: 4.240.000 spori pe grup (adică cinci plăci de agar) pe PDA netamponat (pH 5,63); 13.500.000 și 2.960.000 spori pe grup pe PDA tamponat cu Tris-maleat, pH 5,21 și, respectiv, 6,53. Diapozitivele cu bandă au dezvăluit producția de ascospori pe alte patru medii tamponate (Tris tamponat PDA la pH de 6,61 și 7,61; Tris-maleat tamponat PDA la pH de 8,84 și 7.91) (Tabelul 2), care a fost sub limita de detecție a hemacitometrului (10.000 spori/mL). Producția de chaetoglobosine a și C a fost evaluată conform descrierii anterioare folosind HPLC . Chaetoglobozina C a fost detectată la un pH de 7,01 (o medie de 203 hectolitri pe cinci plăci de agar), dar nu din medii la niciun alt pH (Figura 3). Nu a fost detectată chaetoglobosina a în niciuna dintre probe (datele nu sunt prezentate).
cromatograma HPLC cu spectrele UV ale vârfului selectat inserat. Cromatograma arată semnalul obținut din extractul de metanol din C. globosum cultivate pe cinci citrat fosfat tamponat de cartofi dextroză agar plăci la un pH de 7,01 timp de patru săptămâni. Timpii de retenție (min) sunt reprezentați pe axa x și dimensiunile vârfului (în unități de mili-absorbție) pe axa Y. Pentru spectrul UV( inset), lungimile de undă (în nanometri) sunt reprezentate grafic pe axa x și dimensiunile vârfului (în unități de mili-absorbție) pe axa Y.
puține studii au examinat influența pH-ului ambiental asupra creșterii C. globosum. Intervalul optim de pH pentru creșterea C. globosum a fost descris anterior ca 7,1 până la 10,4 . Rezultatele noastre indică faptul că această ciupercă ar putea crește într-un interval de valori diferite ale pH-ului (aproximativ 4,3 până la 9,4). Deși C. globosum a crescut la un pH de 3,51, aceste colonii erau de dimensiuni mici și aveau o morfologie anormală (Figura 2). Creșterea C. globosum este optimă la un pH neutru (Figura 1).
nivelurile detectabile de chaetoglobosin C au fost observate numai pe mediul cu cele mai mari colonii de C. globosum. Această constatare este în concordanță cu rezultatele noastre dintr-un studiu anterior care sugerează că producția de chaetoglobosine este direct legată de creștere. După examinarea creșterii C. globosum pe patru medii disponibile în comerț, am constatat că mediul care a susținut cea mai bună creștere a susținut și cea mai mare producție de chaetoglobosine a și C.
s-a demonstrat că pH-ul ambiental influențează producția de metaboliți la alte ciuperci filamentoase. Cel mai bine studiat sistem de reglementare este în Aspergillus nidulans, care este controlat de un factor de transcripție numit PacC . În condiții alcaline, PacC activează genele exprimate alcalin, cum ar fi acvA și ipnA, care sunt implicate în sinteza penicilinei și reprimă genele exprimate în acid, cum ar fi stcU, care este implicat în sinteza sterigmatocistinei. Alte ciuperci filamentoase cu omologi PacC includ Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Penicillium chrysogenum, Acremonium chrysogenum , Sclerotinia sclerotiorum și Fusarium verticillioides . O proteină ipotetică similară cu PacC a fost localizată în genomul C. globosum . Presupunând că această ciupercă are un sistem de reglementare similar ca în A. nidulans, aceste rezultate sugerează că producția de chaetoglobozină nu este sub controlul său.
formarea periteciei și ascosporilor de către C. globosum pare a fi favorizată într-un mediu acid și inhibată în condiții de bază pe un mediu artificial. După patru săptămâni, ascosporii au fost prezenți în niveluri detectabile pe PDA netamponat (pH 5,63) și PDA tamponat cu Tris-maleat (pH 5,21 și 6,53) (Tabelul 2). C. globosum a produs în cele din urmă perthecia și ascospori pe PDA tamponat cu citrat-fosfat la opt săptămâni după inoculare. Nu s-au produs ascospori pe PDA tamponat Tris la pH 8.24 sau pe PDA tamponat carbonat-bicarbonat la pH 9,07, 9,25 și 9,35 (Tabelul 2). De asemenea, este posibil ca această inhibare a sporulării la un pH bazic să se datoreze prezenței uneia dintre componentele tamponului, deși mecanismul rămâne necunoscut în prezent.