până acum, în seria plasmidelor 101, am parcurs harta plasmidelor: rezistența la antibiotice, originea replicării și așa mai departe. Până în acest moment ne putem reproduce plasmida și ne putem asigura că celulele o mențin; următorul pas este să facem plasmida să ne exprime gena de interes. Introduceți promotorul-elementul responsabil pentru inițierea transcrierii inserției dvs. în ARN.
în practică, termenul „promotor” descrie combinația promotorului (situsul de legare a ARN polimerazei) și a operatorilor (elemente de răspuns). Promotorii au aproximativ 100 până la 1000 de perechi de baze lungi și se găsesc în amonte de genele lor țintă. Secvența regiunii promotor controlează legarea ARN polimerazei și a factorilor de transcripție, prin urmare promotorii joacă un rol important în determinarea locului și momentului în care va fi exprimată gena dvs. de interes.
ARN polimeraza(s)
ARN este transcrisă din ADN folosind o ARN polimerază (RNAP). În bacterii, acest lucru se face printr-o singură enzimă; cu toate acestea, eucariotele au polimeraze muliple care sunt fiecare responsabile pentru un subset specific de ARN-uri. Pentru a obține această specificitate, rnap eucariotă poate recunoaște și se poate lega de elemente promotor specifice. Aceasta înseamnă că promotorul prezent în coloana vertebrală plasmidă trebuie să fie compatibil cu tipul de ARN care trebuie făcut: dacă doriți ARNm (pentru expresia genelor) trebuie să utilizați un promotor RNAP II, în timp ce ARN-urile mici (cum ar fi shRNA) sunt transcrise de la promotorii RNAP III. Această postare prezintă promotori pentru transcrierea generală RNAP II și RNAP III; cu toate acestea, utilizarea ltr-urilor virale ca promotori RNAP II este frecvent utilizată în constructe lentivirale și retrovirale și le vom discuta într-o postare viitoare pe părțile vectoriale virale.
specificitatea promotorului
în afară de alegerea unui promotor bazat pe tipul de transcriere ARN, va trebui, de asemenea, să vă asigurați că plasmida dvs. are un promotor potrivit pentru a lucra în organismul gazdă. Deoarece mașinile de transcriere diferă între tipurile de celule sau organisme, promotorii trebuie să fie variabili în mod similar. Promotorii bacterieni funcționează numai în celulele procariote și, de obicei, numai în aceleași specii sau în strânsă legătură din care au fost derivate. În mod similar, diferitele tipuri de celule eucariote (mamifere, drojdii, plante etc.) necesită promotori unici și există foarte puține încrucișări. În general, promotorii bacteriilor sunt mai puțin diversi și complexi, având mai puține părți decât cele din celulele eucariote. Unii promotori sunt activi din punct de vedere constitutiv și sunt activi tot timpul, în timp ce alții sunt controlați mai atent. Promotorii reglementați ar putea acționa numai în anumite țesuturi sau în anumite momente de dezvoltare sau pot exista modalități de a le activa sau dezactiva după bunul plac cu o substanță chimică, căldură sau lumină. În celulă, promotorii înșiși sunt controlați de alți factori de reglementare: amplificatori, elemente de graniță, izolatori și amortizoare de zgomot; cu toate acestea, pot apărea unele „scurgeri” de transcriere. În mod normal, aceasta nu este o problemă mare pentru celule, dar poate confunda rezultatele cercetării sau chiar vă poate ucide celulele dacă gena dvs. de interes este toxică. Pentru a combate acest lucru, oamenii de știință au creat promotori sintetici, care includ de obicei o combinație de alte elemente promotoare și tind să fie mai strict reglementați.
promotori comuni pentru eucariote și procariote
am inclus mai jos două tabele de referință care enumeră unii dintre cei mai comuni promotori de bacterii și mamifere. Aceste liste nu sunt în niciun caz exhaustive, dar ar trebui să fie un loc bun pentru a începe atunci când încercați să vă alegeți promotorul perfect!
promotori eucariote
| promotor | utilizat în principal pentru | transcriere ARN | descriere | Expresie | considerații suplimentare |
| CMV | expresie generală | ARNm | promotor puternic al expresiei mamiferelor din citomegalovirusul uman | constitutiv | poate conține o regiune potențatoare. Poate fi redus la tăcere în unele tipuri de celule. |
| EF1a | expresie generală | ARNm | expresie puternică la mamifere din factorul de alungire uman 1 alfa | constitutiv | tinde să dea expresie consistentă indiferent de tipul de celulă sau fiziologie. |
| SV40 | expresia generală | ARNm | promotorul expresiei mamiferelor de la virusul vacuolant simian 40 | constitutiv | poate include un potențator. |
| PGK1 (om sau șoarece) | expresie generală | ARNm | promotor de mamifere din gena fosfoglicerat kinazei. | constitutiv | Expresie larg răspândită, dar poate varia în funcție de tipul de celulă. Tinde să reziste promotor în jos regulament din cauza metilare sau deacetilare. |
| UBC | expresie generală | ARNm | promotor de mamifere din gena umană ubiquitină c | constitutiv | după cum sugerează și numele, acest Promotor este omniprezent. |
| actina beta umană | expresie generală | ARNm | promotor de mamifere din gena beta actină | constitutiv | omniprezent. Versiunea de pui este frecvent utilizată în hibrizii promotori. |
| CAG | expresie generală | ARNm | promotor puternic de mamifere hibride | constitutiv | conține potențiator CMV, promotor de actină beta de pui și acceptor de îmbinare beta-globină de iepure. |
| tre | expresie generală | ARNm | promotor element de răspuns tetraciclină | inductibil cu Tetracilină sau derivații săi. | conține de obicei un promotor minim cu activitate bazală scăzută și mai mulți operatori de tetraciclină. Transcrierea poate fi activată sau dezactivată în funcție de ce este utilizat Tet transactivator. |
| UAS | expresie generală | ARNm | Drosophila promotor conaining site-uri de legare Gal4 | Specific | necesită prezența genei Gal4 pentru a activa promotor. |
| Ac5 | expresie generală | ARNm | promotor puternic de insecte din gena Drosophila Actin 5c | constitutiv | frecvent utilizat în sistemele de Expresie pentru Drosophila. |
| Poliedrin | expresie generală | ARNm | promotor puternic de insecte din baculovirus | constitutiv | frecvent utilizat în sistemele de Expresie pentru celulele insectelor. |
| CaMKIIa | expresia genelor pentru optogenetică | ARNm | Ca2+/promotor protein kinază ii dependent de calmodulină | Specific | utilizat pentru expresia neuronală/SNC. Modulată de calciu și calmodulină. |
| GAL1, 10 | Expresie generală | ARNm | drojdie promotori adiacenți, transcriși divergent | Inductibili cu galactoză; represibili cu glucoză | pot fi utilizați independent sau împreună. Reglementate de GAL4 și GAL 80. |
| tef1 | expresie generală | ARNm | promotor factor de alungire a transcripției drojdiei | constitutiv | Analog promotorului ef1a la mamifere. |
| GDS | expresie generală | ARNm | promotor puternic de expresie a drojdiei din gliceraldehidă 3-fosfage dehidrogenază | constitutiv | foarte puternic, numit și TDH3 sau GAPDH. |
| ADH1 | expresie generală | ARNm | promotor de drojdie pentru alcool dehidrogenază i | reprimat de etanol | versiunea cu lungime completă este puternică cu expresie ridicată. Promotorii trunchiați sunt constituenți cu o expresie mai mică. |
| CaMV35S | expresie generală | ARNm | promotor puternic de plante din virusul mozaicului conopidei | constitutiv | activ în dicots, mai puțin activ în monocots, cu o anumită activitate în celulele animale. |
| UBI | expresie generală | ARNm | promotor de plante din gena ubiquitinei de porumb | constitutiv | oferă o expresie ridicată la plante. |
| H1 | expresia ARN mică | shRNA | din promotorul ARN al polimerazei III umane | constitutiv | poate avea o expresie ușor mai mică decât U6. Poate avea o expresie mai bună în celulele neuronale. |
| U6 | Expresie ARN mic | shRNA | de la om U6 promotor nuclear mic | constitutiv | U6 Murin este de asemenea utilizat, dar poate fi mai puțin eficient. |
promotori Procarioți
| promotor | utilizat în principal pentru | descriere | Expresie | considerații suplimentare |
| T7 | transcripție in vitro/ expresie generală | promotor din bacteriofagul T7 | constitutiv, dar necesită ARN polimerază T7. | atunci când este utilizat pentru transcrierea in vitro, promotorul conduce fie transcrierea sensului, fie a antisensului, în funcție de orientarea sa către gena ta. |
| T7lac | niveluri ridicate de expresie genetică | promotor de la bacteriofagul T7 plus operatorii lac | Expresie bazală neglijabilă atunci când nu este indusă. Necesită polimeraza ARN T7, care este, de asemenea, controlată de operatorul lac. Poate fi indusă de IPTG. | frecvent întâlnite în vectori pET. Foarte strict reglementate de operatorii lac. Bun pentru modularea expresiei genelor prin concentrații variate de inductori. |
| Sp6 | transcripție in vitro/ expresie generală | promotor din bacteriofagul Sp6 | constitutiv, dar necesită ARN polimerază SP6. | polimeraza SP6 are o procesivitate ridicată. Atunci când este utilizat pentru transcrierea in vitro, promotorul conduce fie transcrierea sensului, fie a antisensului, în funcție de orientarea sa către gena ta. |
| araBAD | expresie generală | promotor al operonului metabolic arabinoză | inductibil prin arabinoză și reprimarea catabolitului reprimat în prezența glucozei sau prin legarea competitivă a fucozei anti-inductoare | mai slabă. Frecvent întâlnite în vectorii pBAD. Bun pentru reglarea rapidă și expresia bazală scăzută; cu toate acestea, nu este potrivit pentru modularea expresiei genelor prin concentrații variate de inductor. |
| trp | niveluri ridicate de expresie genetică | promotor de la E. coli triptofan operon | Represibil | devine oprit cu niveluri ridicate de triptofan celular. |
| lac | expresie generală | promotor din lac operon | constitutiv în absența represorului lac (laci sau lacIq). Poate fi indusă de IPTG sau lactoză. | promotor neetanș cu o expresie oarecum slabă. mutația lacIq crește expresia represorului 10x, înăsprind astfel reglarea promotorului lac. Bun pentru modularea expresiei genelor prin concentrații variate de inductori. |
| Ptac | expresie generală | promotor hibrid al lac și trp | reglementat ca promotorul lac | conține -35 regiune din trpB și -10 regiune din lac. Reglementare foarte strictă. Bun pentru modularea expresiei genelor prin concentrații variate de inductori. În general, o expresie mai bună decât lac singur. |
| pL | niveluri ridicate de expresie genetică | promotor de la bacteriofag lambda | poate fi reglabil la temperatură | adesea asociat cu represorul cI857 sensibil la temperatură. |
| T3 | transcriere in vitro/expresie generală | promotor din bacteriofagul T3 | constitutiv, dar necesită ARN polimerază T3 | atunci când este utilizat pentru transcrierea in vitro, promotorul conduce fie transcrierea sensului, fie antisens în funcție de orientarea sa către gena dumneavoastră |
deși această listă este un loc minunat pentru a începe, tabelele de mai sus nu se adâncesc în țesuturile sau promotorii specifici dezvoltării disponibili oamenilor de știință. Plasmidele sunt adesea folosite în scopuri terapeutice și, în aceste cazuri, este important să se identifice promotorii potriviți specifici țesuturilor, așa cum sunt descriși de cercetătorii de la NIH aici.
notă: A. Max Juchheim a contribuit la scrierea acestui articol.