O prezentare generală a Chimogeneticii

datorită evoluțiilor semnificative în tehnicile neuroștiinței, cercetătorii sunt acum capabili să exploateze selectiv sistemele neuronale la animalele conștiente, prin metode emergente numite chemogenetică și optogenetică. Aceste metode ajută la explorarea circuitelor neuronale care stau la baza comportamentelor complicate în boli și sănătate.

Chemogenetica și optogenetica prezintă asemănări în abordarea lor de modificare a activității neuronale; de exemplu, în ambele tehnici, canalele ionice sau receptorii proiectați trebuie introduși în anumite regiuni ale creierului, prin expresia plasmidă sau sistemele vectoriale virale. În optogenetică, canalele ionice sensibile la lumină bacteriene trebuie exprimate și fibrele optice trebuie, de asemenea, utilizate ulterior pentru a inhiba sau activa activitatea neuronală in vivo sau in vitro (Boyden și colab., 2005; Zhang și colab., 2007).

deși această metodă oferă un control temporal superior al activității neuronale in vivo, se știe că este inerent invazivă și are nevoie de implantarea cerebrală a fibrelor optice. Chemogenetica, pe de altă parte, nu are nevoie de un implant cronic, dar menține potențialul de a controla activitatea neuronală. Acest lucru se realizează prin administrarea de liganzi, selectivi pentru canalele ionice sau receptorii proiectați, care altfel sunt inerți (Armbruster și colab., 2007; Campbell & Marchant, 2018). Tabelul 1 prezintă principalele caracteristici ale chimogeneticii și optogeneticii.

Tabelul 1. Chemogenetica vs optogenetica

Istorie și dezvoltare

RASSLs

Chemogenetica se referă la utilizarea canalelor ionice sau a receptorilor modificați genetic și a liganzilor selectivi care activează acești receptori pentru a facilita manipularea activității neuronale. În acest context, receptorii cuplați cu proteine G (GPCR) au condus dezvoltarea chimogeneticii, iar lucrarea originală care definește GPCR-urile care reacționează numai la liganzii sintetici a fost publicată în 1998.

acești receptori-cunoscuți ca receptori activați exclusiv de un Ligand sintetic (RASSLs) — au fost aplicați eficient in vivo, de exemplu, pentru a controla de la distanță activitatea cardiacă. În ciuda acestui fapt, aplicarea RASSLs în neuroștiințe a fost limitată de activitatea endogenă a receptorilor în absența ligandului lor particular și a activității farmacologice a liganzilor in vivo (Coward și colab., 1998; Sternson & Roth, 2014).

DREADDs

ultimii ani au văzut dezvoltarea receptorilor de Designer activați exclusiv de medicamentele de Designer (DREADDS). Receptorii muscarinici umani mutați stimulați numai de liganzi inerți au fost primii DREADD care au fost dezvoltați (Armbruster și colab., 2007). Prin mai multe runde de mutageneză și screening împotriva ligandului inert biologic clozapină N-oxid (CNO), au fost identificați receptorii muscarinici cuplați la calea de semnalizare intracelulară Gaq.

receptorii cuplați la această cale sunt capabili să activeze activitatea neuronală ca răspuns la CNO. Concentrațiile scăzute de CNO activează toate cele trei Gaq-DREADDs — hM1Dq, hM3Dq și hM5Dq (Roth, 2016). Mai mult, același studiu a arătat că hM4Di și hM2Di pot inhiba activitatea neuronală prin cuplarea lor la căile de semnalizare intracelulară Gai. Aceste dreaduri inhibitoare răspund, de asemenea, la CNO (Armbruster și colab., 2007; Figura 1).

Figura 1. Mecanismul de acțiune al liganzilor DREADD. Legarea liganzilor DREADD la Gaq-DREADDs provoacă tragere neuronală, în timp ce legarea la Gai-DREADDs are ca rezultat inhibarea activității neuronale. Diclorhidratul de N-oxid de clozapină și agonistul DREADD 21 sunt agoniști dread muscarinici neselectivi și astfel pot activa sau inhiba activitatea neuronală, în funcție de receptorul specific exprimat. Salvinorina B este selectivă pentru receptorul KORD, care este cuplat la semnalizarea GaI, în consecință legarea are ca rezultat inhibarea activității neuronale. Credit imagine: Tocris Bioscience

legarea dintre Gaq-DREADDs și CNO determină stimularea fosfolipazei C (PLC), care catalizează conversia fosfatidilinozitolului 4,5-bifosfat (PIP2) la 1,2-diacilglicerol (DAG) și inozitol 1,4,5-trisfosfat (IP3). Atât dag, cât și IP3 posedă funcții de mesager secundar: acesta din urmă se leagă de receptorii săi pentru a declanșa eliberarea de Ca2+ din depozitele intracelulare, în timp ce primul stimulează diferite forme de protein kinază C (PKC).

legarea dintre Gai-DREADDs și CNO determină inhibarea adenilil ciclazei (AC), ducând la scăderea nivelului de cAMP intracelular. Deoarece atât EPAC, cât și protein kinaza A (PKA) sunt activate de cAMP, acțiunea CNO la Gai-DREADDs inhibă semnalizarea EPAC și PKA în aval (vezi Figura 1).

CNO este un metabolit al clozapinei, studiile indică faptul că aceasta este o conversie bidirecțională și că CNO poate suferi metabolizare inversă la clozapină. Când CNO este administrat la concentrațiile necesare pentru a activa Dreadd-urile, clozapina este ulterior capabilă să activeze receptorii endogeni (Gomez și colab., 2017). Clozapina — un antipsihotic atipic-acționează la o serie de ținte și duce la multe efecte comportamentale diferite.

șobolanii, șoarecii, oamenii, primatele neumane și cobaiii prezintă metabolismul reversibil al CNO la clozapină (Gomez și colab., 2017; Manvich și colab., 2018). Ca urmare a potențialului metabolizare inversă a CNO, studiile de relație structură-activitate au evoluat pentru a dezvolta liganzi stabili, alternativi.

puternicul ligand DREADD — DREADD agonist 21 — a fost inițial analizat pentru activitatea împotriva hM3Dq. Medicamentul aprobat perlapina a fost identificat ca un agonist puternic hM3Dq în aceeași cercetare. În Japonia, acest medicament a fost aprobat ca sedativ și hipnotic (Chen și colab., 2015). Atât perlapina, cât și agonistul DREADD 21 s-au dovedit ulterior a fi agoniști puternici ai hM4Di, hM3Dq și hM1Dq, cu o activitate puțin sau deloc în afara țintei. Mai mult, agonistul DREADD 21 a fost testat in vivo, în care s-a demonstrat că activează neuronii care exprimă hM3Dq și inhibă activitatea neuronilor care exprimă hM4Di (Thompson și colab., 2018).

ca urmare a dezvoltării dreadurilor muscarinice, a fost creat un dread inhibitor din receptorul de opioide (Kord). Activarea acestui dread inhibitor se realizează prin legarea ligandului Salvinorin B, rezultând inhibarea activității neuronale prin semnalizarea Gai. Pentru a permite controlul bidirecțional al activității neuronale, KORD poate fi utilizat alături, activând Dreadd-uri precum hM3Dq (Vardy și colab., 2015).

unele caracteristici comune în toate Dreadd-urile le fac potrivite pentru aplicarea în experimentele de neuroștiință. În primul rând, Dreadd-urile nu prezintă niciun răspuns la liganzii endogeni din cauza mutațiilor genetice din siturile lor de legare a ligandului care elimină legarea, ceea ce înseamnă că orice activitate a DREADD-ului va fi doar din cauza aplicațiilor ligandului DREADD specific. În al doilea rând, expresia in vitro sau in vivo a Dreadd-urilor nu are niciun impact asupra comportamentelor de bază, a funcției neuronale sau a activității celulare, înainte de adăugarea ligandului DREADD (Sternson & Roth, 2014).

PSAMs/PSEMs

în timp ce DREADDs și RASSLs se bazează pe GPCR-uri, canalele ionice modificate numite module de acționare Selective farmacologic (PSAM), au fost de asemenea utilizate pentru modularea activității neuronilor. PSAM – urile se bazează pe studii care indică faptul că este posibil să se transplanteze domeniul de legare extracelulară a ligandului receptorului ACH nicotinic (nachr) din cadrul receptorului ACH nicotinic de la numărul 7 pe domeniul porilor ionici al altor canale ionice legate de ligand. Atunci când domeniul de legare a ligandului nachr de la 7 la 7 este îmbinat cu domeniul porilor ionici ai receptorului 5-HT3, se produce un canal ionic cu farmacologie nachr de la 7 la 7, dar cu proprietăți De conducere a cationilor de la 5-HT3 (Eisel de la 5 la 3 și colab., 1993).

de asemenea, îmbinarea domeniului de legare a ligandului nachr de la 7 la 7 cu domeniul porilor ionici al receptorului glicinei selective a clorurii (GlyR) produce un canal de clorură receptiv la ACh (Grutter și colab., 2005). În consecință, mutația selectivă a domeniului de legare a ligandului nachr de la 7 la 7 generează canale ionice PSAM, care nu prezintă nicio legare ACh, dar sunt încă legate selectiv de compuși numiți molecule efectoare selective farmacologic (psem).

PSAM-urile sau canalele ionice himerice care permit reglarea conductanței anionice sau cationice au fost produse prin combinarea domeniului de legare a ligandului nachr (care conține două sau una mutații) cu domeniul porilor ionici al mai multor canale ionice cu legătură ligand variată. Astfel de himere PSAM sunt denumite pe baza mutațiilor lor,precum și a domeniului porilor ionici legați — PSAML141F, Y115F-GlyR, PSAML141F-GlyR,PSAML141F, Y115F-GABAC și PSAML141F,Y115F-5-HT3. Activarea activității neuronale este activată de himerele care conțin 5-HT3, în timp ce himerele care conțin GABAC și GlyR sunt inhibitoare (vezi Figura 2) (Magnus și colab., 2011; Sternson & Roth, 2014).

Figura 2. Mecanismul de acțiune al PSEMs. PSAM-urile de activare sunt compuse dintr-un domeniu de legare a ligandului nachr nachr mutant, îmbinat cu domeniul porilor ionici ai unui canal selectiv al cationilor, cum ar fi 5-HT3. Legarea psem-urilor la activarea PSAM-urilor are ca rezultat un aflux de cationi și activarea activității neuronale. PSAM-urile inhibitoare sunt compuse dintr-un domeniu mutant de legare a ligandului nachr de la 7 la 7, îmbinat cu poredomeniul ionic al unui canal selectiv anionic, cum ar fi GlyR. Legarea psem-urilor la PSAM-urile inhibitoare are ca rezultat un aflux de anioni și inhibarea activității neuronale. Credit de imagine: Tocris Bioscience

recenzii științifice pentru lecturi suplimentare

• Campbell & Marchant (2018) utilizarea chimogeneticii în neuroștiința comportamentală: variante de receptori, abordări de direcționare și avertismente. Br J Pharmacol. 175, 994.
• Roth (2016) DREADDs pentru neurologi. Neuron. 89, 683.
• Magnus și colab. (2011) ingineria chimică și genetică a interacțiunilor selective ale canalelor ligand-ion. Știință. 333, 1292.
• Sternson & Roth (2014) instrumente Chemogenetice pentru interogarea funcțiilor creierului. Annu Rev Neurol. 37, 387.

1. Armbruster și colab. (2007) evoluând blocarea pentru a se potrivi cheii pentru a crea o familie de receptori cuplați cu proteine G activați puternic de un ligand inert. Proc Natl Acad Sci Statele Unite ale Americii. 104, 5163.
2. Atasoy și colab. (2012) deconstrucția unui circuit neural pentru foame. Natura. 488, 172.
3. Boyden și colab. (2005) milisecundă-interval de timp, controlul optic orientat genetic al activității neuronale. Nat Neurosci. 8, 1263.
4. Bradley & Tobin (2016) proiectarea medicamentelor receptorului cuplat cu proteina G de generație următoare: legarea farmacologiei noi și a modelelor animale in vivo. Anu Rev Pharmacol Toxicol. 56, 535.
5. Bradley și colab. (2018) utilizarea abordărilor chemogenetice pentru a studia rolurile fiziologice ale receptorilor muscarinici de acetilcolină în sistemul nervos central. Neurofarmacologie. 136, 421.
6. Chen și colab. (2015) primele studii de relație structură-activitate pentru receptorii de designer activate exclusiv de medicamentele de designer. ACS Chem Neuroscience. 6, 476.
7. Coward și colab. (1998) controlul semnalizării cu un receptor cuplat Gi special conceput. Proc Natl Acad Sci Statele Unite ale Americii. 95, 352.
8. Eisel si colab. (1993) receptorul chimaeric nicotinic-serotoninergic combină legarea ligandului și specificitățile canalului. Natura. 366, 479.
9. Ge și colab. (2017) proiecții glutamatergice de la cortexul entorhinal la girusul dentat dorsal mediat reintegrarea indusă de context a căutării heroinei. Neuropsihofarmacologie. 42, 1860.
10. Gomez și colab. (2017) chemogenetica a dezvăluit: ocuparea DREADD și activarea prin clozapină convertită. Știință. 357, 503.
11. Grutter și colab. (2005) reglarea moleculară a închiderii rapide în canalele ionice cu ligand pentameric. Proc Natl Acad Sci Statele Unite ale Americii. 102, 18207.
12. Jiang și colab. (2018) neuronii colinergici din septul medial mențin comportamente asemănătoare anxietății induse de durerea inflamatorie cronică. Neurosci Lett. 671, 7.
13. Manvich și colab. (2018) agonistul DREADD clozapină N-oxid (CNO) este metabolizat invers la clozapină și produce efecte de stimulare interoceptivă asemănătoare clozapinei la șobolani și șoareci. Sci Rep. 8, 3840.
14. Rapanelli și colab. (2017) modularea histaminei a circuitelor ganglionilor bazali în dezvoltarea îngrijirii patologice. Proc Natl Acad Sci Statele Unite ale Americii. 114, 6599.
15. Sasaki și colab. (2011) modularea farmacogenetică a neuronilor orexinei modifică stările de somn/veghe la șoareci. PLoS Unu. 6, e20360.
16. Schwartz și colab. (2017) reglementarea Cortico-accumbens a comportamentului de abordare-evitare este modificată de experiență și durere cronică. Celula Rep. 19, 1522.
17. Thompson și colab. (2018) DREADD agonist 21 (C21) este un agonist eficient pentru dread-urile pe bază de muscarină in vitro și in vivo. ACS Pharmacol Transl Sci. Epub înainte de imprimare.
18. Vardy și colab. (2016) un nou DREADD facilitează interogarea chemogenetică multiplexă a comportamentului. Neuron. 86, 936.
19. Varela și colab. (2016) urmărirea rolului dependent de timp al hipocampului în amintirea memoriei folosind DREADDs. PLoS Unu. 11, e0154374.
20. Zhang și colab. (2007) interogare optică rapidă multimodală a circuitelor neuronale. Natura. 446, 633.

despre Tocris Bioscience

Tocris Bioscience este furnizorul dvs. de încredere de reactivi de înaltă performanță pentru știința vieții, inclusiv agoniști ai receptorilor & antagoniști, inhibitori ai enzimei, modulatori ai canalelor ionice, sonde fluorescente & coloranți și biblioteci compuse. Catalogul nostru este format din peste 4.500 de instrumente de cercetare, care acoperă peste 400 de ținte de proteine, permițându-vă să investigați și să modulați activitatea a numeroase căi de semnalizare și procese fiziologice.

lucrăm cu oameni de știință de peste 30 de ani pentru a oferi comunității științei vieții standarde de cercetare, precum și instrumente de cercetare noi și inovatoare. Înțelegem nevoia cercetătorilor de a avea încredere în reactivii lor de cercetare, motiv pentru care ne-am angajat să furnizăm clienților noștri produse de cea mai înaltă calitate disponibile, astfel încât să puteți publica cu încredere.

Tocris face parte din Divizia de științe proteice A Bio-Techne, care include, de asemenea, cele mai bune mărci din clasa R &D Systems, Novus Biologicals, ProteinSimple și advanced Cell Diagnostics. Bio-Techne a unit aceste mărci pentru a oferi cercetătorilor un portofoliu complet de reactivi de Cercetare, Teste și platforme proteice. Pentru mai multe informații despre Bio-Techne și mărcile sale, vă rugăm să vizitați bio-techne.com.

Politica de conținut sponsorizat: News-Medical.net publică articole și conținut înrudit care pot fi derivate din surse în care avem relații comerciale existente, cu condiția ca un astfel de conținut să adauge valoare etosului editorial de bază al News-Medical.Net care este de a educa și informa vizitatorii site-ului interesați de cercetare medicală, știință, dispozitive medicale și tratamente.

Citate