mutație unică la o regiune foarte conservată de cloramfenicol acetiltransferază permite producerea de acetat de izobutil direct din celuloză de către Clostridium thermocellum la temperaturi ridicate

tulpini bacteriene și plasmide

tulpini bacteriene și plasmide utilizate în acest studiu sunt enumerate în tabelul 2. Clostridium thermocellum dsm1313 tulpina HPT (m1354) a fost utilizată ca gazdă pentru producerea esterilor la temperaturi ridicate. Trebuie remarcat faptul că ștergerea genei hipoxantin fosforibosiltransferazei (hpt, Clo1313_2927) în tipul sălbatic DSM1313 permite ingineria genetică prin selecția contra 8-azahipoxantină (8-AZH); această ștergere nu are niciun efect advers cunoscut asupra creșterii și metabolismului celular . Plasmida pNW33N, care conține CATSa, este termostabilă și a fost utilizată pentru a exprima diferite pisici în C. thermocellum. Plasmidele pET au fost utilizate pentru clonarea moleculară și exprimarea enzimelor în E. coli.

produse chimice și reactivi

toate produsele chimice au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (MO, SUA) și/sau Thermo Fisher Scientific (MA, SUA), cu excepția cazului în care se specifică în altă parte. Pentru clonarea moleculară, enzimele de restricție și ligaza T4 au fost obținute de la New England Biolabs (MA, SUA). Phusion Hot Start ii ADN polimeraza a fost utilizată pentru reacția în lanț a polimerazei (PCR).

medii și cultivare

pentru clonarea moleculară și exprimarea proteinelor, tulpinile de E. coli au fost cultivate în bulion de lizogenie (LB) conținând antibiotice adecvate, cu excepția cazului în care se specifică altfel. Pentru caracterizarea in vivo a CATSa în E. coli s-a utilizat mediul hibrid M9 cu 20 g/L glucoză. Pentru cultura C. thermocellum, s-a utilizat mediul minimal MTC sau mediul CTFuD-NY, așa cum se specifică în experimente. Densitatea optică (OD) a fost măsurată printr-un spectrofotometru la lungimea de undă de 600 nm (Spectronic 200+, Thermo Fisher Scientific, MA, SUA).

analiza alinierii secvențelor Multiple

analiza alinierii secvențelor Multiple (MSA) a fost efectuată utilizând MEGA7 . Secvențele de proteine au fost aliniate de ClustalW și vizualizate de ESPript 3.0 (http://espript.ibcp.fr) . Caracteristicile cheie ale structurilor proteice ale 3U9F, 4cla și 2xat au fost extrase din CAT_SALTI, CAT3_ECOLIX și, respectiv, CAT4_PSEAE.

modelare moleculară și simulări de andocare

structuri tridimensionale (3D)

structura 3D a catsa și a alcoolilor de interes a fost generată pentru prima dată folosind modelul elvețian și instrumentele ‘Builder’ ale MOE (Molecular Operating Environment software, versiunea 2019.01). Structura 3D a complexului CATSa delimitat cu substrat dublu (adică acetil-CoA–izobutanol–CATSa) a fost obținută prin extragerea unui izobutanol din complexul izobutanol–CATSa și apoi adăugarea acestuia la complexul acetil-CoA–CATSa. Toate structurile au fost pregătite de instrumentul’ QuickPrep ‘ al MOE cu parametri impliciți și optimizate în continuare prin minimizarea energiei cu câmpul de forță Amber10:EHT.

simulare de andocare

pentru a efectua simulări de andocare, potențialul buzunar de legare a fost căutat folosind instrumentul ‘Site Finder’ al MOE. Situl cu cel mai bun punctaj, în concordanță cu siturile catalitice raportate , a fost selectat pentru studii suplimentare. Simulările de andocare au fost efectuate așa cum s-a descris anterior . Pe scurt, acetil-CoA și fiecare alcool au fost andocate folosind protocolul de potrivire indusă cu metoda de plasare a triunghiului și funcția de notare a londonezilor de la Londra. După simulările de andocare, s-a selectat poziția de legare cu cel mai bun punctaj, care arată interacțiunea crucială dintre reziduu și substrat la deviația rădăcină-medie-pătrată (RMSD) < 2 INKT. De exemplu, pentru andocarea acetil-CoA, a fost aleasă poziția de legare care prezintă legătura de hidrogen dintre hidroxilul Ser-148 și N71 al CoA . Pentru andocarea alcoolului, a fost selectată poziția de legare care arată legătura de hidrogen dintre N3 din His-189 și hidroxilul alcoolului .

analiza mutagenezei in silico

analiza mutagenezei in silico a complexului acetil-CoA–izobutanol–CATSa a fost efectuată conform descrierii anterioare . În mod specific, instrumentele de scanare a alaninei și de scanare a reziduurilor ale MOE au fost utilizate pentru a identifica potențialii candidați la reziduuri pentru mutageneză.

clonare moleculară

construcție plasmidă

plasmidele au fost construite prin tehnica standard de clonare moleculară a metodei dependente de ligază și/sau a ansamblului Gibson folosind primerii enumerați în fișierul suplimentar 1: Tabelul S1. Plasmidele construite au fost introduse în E. coli TOP10 prin transformarea șocului termic. Coloniile izolate pe o placă selectivă au fost ecranate PCR și purificate cu plasmidă. Plasmidele purificate au fost verificate prin secvențierea Sanger înainte de a fi transformate în E. coli BL21 (de3). Mutageneza direcționată la fața locului a fost efectuată utilizând protocolul de mutageneză direcționat la fața locului quickchange viii cu lungime redusă de suprapunere sau metoda de asamblare Gibson . Pentru C. termocel inginerie, plasmida pHS005 a fost construită mai întâi și apoi modificată la pHS0024. pHS0024 nu are hpt în aval de operon, în timp ce alte secvențe ale plasmidei sunt identice cu pHS005.

transformare

metodele convenționale de transformare chimică și electroporare au fost utilizate pentru transformarea E. coli și , respectiv, a C. thermocellum. Pentru C. termocelul, metoda, totuși, a fost ușor modificată așa cum este descris aici. În primul rând, C. thermocellum M1354 (Tabelul 2) a fost cultivat în mediu CTFuD-NY de 50 mL la 50 CTC în interiorul unei camere anaerobe (Bactron300, Sheldon manufacturing Inc., SAU, SUA). Cultura celulară cu OD într–un interval de 0,8-1,0 a fost răcită la temperatura camerei timp de 20 min. Dincolo de acest punct, toate etapele au fost efectuate în afara camerei. Celulele răcite s-au recoltat la 6500 XTX g și 4 XTX C timp de 20 min. Peletele celulare au fost spălate de două ori cu apă Milli-Q răcită cu gheață și omogenizate în 200 ecql din tamponul de transformare format din zaharoză de 250 mM și glicerol de 10% (v/v). Mai multe alicote de 30 de unqq din celulele electrocompetente au fost depozitate imediat la − 80 unqqc pentru utilizare ulterioară. Pentru electroporare, celulele electrocompetente au fost dezghețate pe gheață și incubate cu 500-1000 ng de plasmide metilate timp de 10 min. Apoi, celulele au fost transferate într-o cuvă de electroporare cu decalaj de 1 mm răcită cu gheață (aparatul BTX Harvard, MA, SUA) urmată de două impulsuri consecutive de dezintegrare exponențială cu 1.8 kV, 350 INT. si 25 int. Impulsurile au dus de obicei la o constantă de timp de 7,0–8,0 ms. Celulele au fost imediat resuspendate în ctfud-NY proaspăt preîncălzit și recuperate la 50 C în condiții anaerobe (90% N2, 5% H2 și 5% CO2) în interiorul unui tub Balch acoperit cu cauciuc. După 0-12 ore de recuperare, celulele au fost amestecate cu un mediu de agar ctfud-NY topit, suplimentat cu 15 hectog/mL tiamfenicol. În cele din urmă, amestecul cu celule medii a fost turnat pe un vas petri și solidificat în interiorul camerei anaerobe. Placa a fost incubată la 50 C până la 1 săptămână până la apariția coloniilor. Eficiența transformării a fost de 2-100 unități de formare a coloniilor pe plasmidă de tip ectg (CFU / plasmidă de tip ectg).

caracterizarea in vivo a CATSa și a variantelor sale în E. coli

pentru caracterizarea in vivo a CATSa și a variantelor sale în E. coli, s-au efectuat culturi cu densitate celulară ridicată, așa cum s-a descris anterior, cu un adaos de 2 g/L de diferiți alcooli. Pentru extracția in situ a esterilor, fiecare tub a fost suprapus cu 25% (v/v) hexazecan. Pentru a confirma expresia proteică a CATSa și a variantelor sale, 1% (v/v) din celulele stoc au fost cultivate peste noapte la 37 C și 200 RPM în tuburi de cultură de 15 mL conținând 5 mL de mediu LB și antibiotic. Apoi, 4% (v/v) din culturile peste noapte au fost transferate în 1 mL de mediu LB care conține antibiotic într-o microplacă cu 24 de godeuri. Culturile au fost cultivate la 37 C și 350 rpm folosind un agitator de microplăci incubatoare (Fisher Scientific, PA, SUA) până când OD a ajuns la 0,4–0,6 și apoi indusă de 0.1 mm izopropil-D-1-tiogalactopiranozidă (IPTG) timp de 4 ore cu o membrană de etanșare Breathe-Easy pentru a preveni evaporarea și contaminarea încrucișată (cat# 50-550-304, Research Products International Corp., IL, SUA). Probele de proteine au fost obținute folosind reactivul complet B-PER (cat# 89822, Thermo Scientific, MA, SUA), conform instrucțiunilor producătorului și analizate de SDS-PAGE.

caracterizarea enzimei

purificarea his-tag

pentru exprimarea enzimei, o cultură peste noapte a fost inoculată cu un 1:Raportul 50 în mediu LB proaspăt care conține 1 mm IPTG și antibiotic, urmat de incubarea peste noapte 18 C (până la 20 h) într-un incubator de agitare la 200 rpm. Celulele induse au fost recoltate prin centrifugare la 4 centimetrii C și 4700 centimetrii g timp de 10 min. Peleta celulară a fost apoi spălată o dată cu apă Millipore și omogenizată în reactivul complet B-PER. După 30 de minute de incubare la temperatura camerei, amestecul a fost centrifugat la 17.000 de centi g timp de 2 min. Supernatantul a fost colectat și desemnat ca extract brut. Pentru purificarea his-tag, extractul brut a fost incubat cu hispur Ni–NTA superflow agarose într-un lot, așa cum recomandă producătorul. Apoi, rășina a fost spălată cu cel puțin trei volume de tampon de spălare, constând din 50 mM Tris–HCl (pH 8,0), 300 mm NaCl, 10 mm imidazol și 0,1 mm EDTA. Proteinele legate de rășină au fost eluate cu un tampon de eluție de 300 ilqql conținând 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM Naci, 300 mm imidazol și 0,1 mm EDTA. Proba eluată a fost apoi desalinizată și concentrată printr-o coloană de filtru Amicon cu întrerupere a greutății moleculare de 10 kDa. În cele din urmă, proba de proteine a fost suspendată în 200 unqql de tampon Tris–HCl de 20 mM (pH 8,0). Concentrația proteică a fost măsurată prin testul Bradford cu albumina serică bovină (BSA) ca proteină de referință.

test de deplasare termică

pentru a măsura temperatura de topire a proteinelor (Tm), s-a utilizat un test de termofluor cu Sypro Orange . Aproximativ 10-250 de kilograme de proteine purificate His-tag au fost amestecate cu 5 portocale sypro de la 50 de kilograme într-un volum final de 50 de kilograme într-o placă qPCR de 96 de godeuri. Placa a fost sigilată cu capace PCR înainte de a rula testul. Mașina StepOne real-time PCR (Applied Biosystems, ca, SUA) a fost utilizată pentru a rula testul cu următorii parametri: reporter ROX, increment C de 1 hectar pe ciclu, așteptare de 1 minut la fiecare ciclu și interval de temperatură de la 20 la 98 CTC.datele au fost colectate, exportate și prelucrate pentru a calcula Tm.

5,5′-ditiobis-(acid 2-nitrobenzoic) (dtnb)

viteza de reacție pentru fiecare pisică a fost determinată printr-un test DTNB pe o placă cu 384 de puțuri. Volumul total al reacției a fost de 50 ecql, tamponul de reacție cuprinzând Tris–HCl de 50 mM (pH 8,0). Concentrațiile de acetil-CoA (CoALA Biosciences, TX, SUA) și alcooli au fost variate după cum se specifică în fiecare experiment. Pentru reacțiile la cloramfenicol și, respectiv, la alcooli, s-au utilizat concentrații enzimatice finale de 0,05%/ml și 10%/ml. Cinetica reacției a fost colectată prin măsurarea absorbanței la 412 nm în fiecare minut timp de 1 oră la 50 centimetric C într-un cititor de microplăci (Synergy HTX microplăci reader, BioTek). Rata de reacție a fost calculată folosind coeficientul de extincție dintr-o curbă standard a coenzimei libere a (MP Biomedicals, OH, SUA) în aceeași condiție. Trebuie remarcat faptul că, deoarece temperatura maximă de funcționare recomandată pentru cititorul de plăci este de 50 CTC, testul enzimatic cu randament ridicat pentru CAT la temperaturi ridicate a fost efectuat numai pentru a determina parametrii cineticii enzimatice.

calculul parametrilor cinetici pentru ratele de reacție

parametrii legii ratei Michaelis–Menten (Eq. 1) au fost calculate pentru fiecare enzimă după cum urmează. În primul rând, regresia liniară a fost efectuată pe datele colectate de la un cititor de microplăci pentru a identifica ratele inițiale de reacție, \(Y_{i}\), la diferite concentrații inițiale de substrat, \(s_{i}\), unde i = {1,2,…, n} este numărul de puncte de date colectate. Apoi, aceste rate de reacție inițiale și concentrațiile inițiale de substrat asociate pentru toate replicatele au fost simultan potrivite modelului Michaelis-Menten (Eq. 1) Utilizarea regresiei neliniare robuste (Eq. 2) cu un estimator de pierderi soft-L1 (Eq. 3) așa cum este implementat în SciPy numerical computing library v1. 2. 0 :

problema celor mai mici pătrate determină parametrii \(K_{\text{m}}\) și \(v_{ \text{max} }\) prin minimizarea diferenței dintre ratele de reacție prezise de model \(v_{i}\) și ratele de reacție măsurate \(y_{i}\) (Eq. 2). O funcție de netezire \(\rho \ stânga (z \dreapta)\) este utilizată pentru a face cea mai mică problemă pătrată rezistentă la valori aberante (Eq. 3). Datorită rezistenței imparțiale la valori aberante și evitării erorilor rezultate din metodele convenționale de liniarizare, regresia neliniară robustă oferă cea mai precisă estimare a parametrilor pentru modelul Michaelis-Menten .

producția de acetat de izobutil în C. thermocellum

fermentarea Celobiozei

producția de acetat de izobutil din celobioză în tulpini de C. thermocellum a fost realizată prin configurația de bioconversie în două etape. Celulele au fost mai întâi cultivate în mediu minim MTC conținând 5 g/l celobioză într–un tub de Balch acoperit cu cauciuc până când OD a ajuns la 0,8-1.0. Celulele s-au răcit la temperatura camerei timp de 20 min și s-au centrifugat la 4700 XTX g și 4 XTX C timp de 20 min. După îndepărtarea supernatantului, celulele au fost omogenizate în același volum de mediu minim MTC proaspăt conținând 2 g / L izobutanol într-o cameră anaerobă. Suspensia celulară a fost apoi divizată în 800 xqtl într-un tub de microcentrifugă cu capac filetat de 2,0 mL, cu o acoperire hexazecană de 200 xqtl. Celulele au fost incubate la 55 C pentru 24 h, urmate de analiza cromatografiei în fază gazoasă cuplată cu un spectrometru de masă (GC/MS) pentru a cuantifica cantitatea de acetat de izobutil produsă.

fermentarea celulozei

pentru fermentarea celulozei s-a utilizat mediu MTC modificat (mediu c-MTC). 20 g/L de Avicel PH-101 a fost utilizat ca sursă unică de carbon în loc de celobioză și s-au adăugat 10 g / l de mopuri pentru a crește capacitatea tampon. PH-ul inițial a fost ajustat la 7,5 pe 5 m KOH și autoclavizat. Într-o cameră anaerobă, s-au inoculat 0,8 mL de cultură celulară peste noapte în 15,2 mL de mediu C-MTC (raport de inoculare 1:20) cu 4 mL de hexazecan suprapus. Fiecare tub conținea o mică bară de agitator magnetic pentru a omogeniza celuloza. Tubul de Balch cu capac din cauciuc a fost incubat într-o baie de apă conectată cu un regulator de temperatură setat la 55 C și un sistem de agitare magnetică. În urma ajustării pH–ului cu 70 xqtl de 5 m KOH injecție, 800 xqtl de cultură celulară și 200 xqtl de strat de hexazecan au fost prelevate la fiecare 12 h. pH-ul Culturii a fost menținut într-un interval de 6,4-7,8 în timpul fermentației.

creșterea celulară a fost monitorizată prin măsurarea proteinei pe peleți. Peleta celulă-celuloză din 800 de volume de eșantionare a fost spălată de două ori cu apă Milli-Q și suspendată cu un tampon de liză de 200 unkticli (0.2 m NaOH, 1% SDS) urmată de o incubare oră la temperatura camerei. Apoi, soluția a fost neutralizată cu 50 0,8 m HCL și diluată cu 550 de 550 de litri de apă. Amestecul a fost centrifugat la 17.000 de grame pentru 3 min. Concentrația de proteine din supernatant a fost analizată prin testul Bradford compatibil cu detergentul (Thermo Scientific, WA, SUA). Peleta reziduală a fost fiartă într-un cuptor de 98 de centimetrii timp de o oră înainte de a cuantifica celuloza reziduală.

celuloza reziduală a fost cuantificată prin metoda acidului fenol–sulfuric cu unele modificări. Proba fiartă a fost spălată de două ori cu apă Milli-Q și suspendată în apă de 800 unktil pentru a obține un volum echivalent cu cel original. Eșantionul a fost omogenizat prin pipetare și vortexare timp de 10 s, iar 20 de centicli din eșantionul omogenizat au fost transferați într-un nou tub de microcentrifugă de 2,0 mL sau într-o placă de 96 de godeuri și uscați peste noapte într-un cuptor de 55 de centicli. Peleta uscată a fost suspendată în 200 de centicli de acid sulfuric 95% și incubată timp de o oră la temperatura camerei. După ce peleta a fost dizolvată complet, s-au adăugat 20 de centicli de fenol 5% și s-au amestecat cu soluția de acid sulfuric. După 30 de minute de incubare la temperatura camerei, 100 de centicli din eșantion au fost transferați pe o nouă placă cu 96 de puțuri și s-a măsurat absorbanța la 490 nm. Absorbanța a fost transformată în concentrație de celuloză prin curba standard a Avicel PH-101 tratată prin aceeași procedură.

metode analitice

cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC)

metaboliții extracelulari au fost cuantificați utilizând un sistem de cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) (Shimadzu Inc., MD, SUA). S-au centrifugat 800 OQQ de probe de cultură la 17.000 OQQ g timp de 3 min, apoi supernatanții au fost filtrați prin filtre de 0,2 oqqm și executați cu 10 mn H2SO4 fază mobilă la 0,6 mL/min pe un AMINEX HPX-87H (Biorad Inc., Ca, SUA) coloana la 50 C. detectorul indicelui de refracție (RID) și detectorul ultra-violet (UVD) la 220 nm au fost utilizate pentru monitorizarea concentrațiilor de zaharuri, acizi organici și alcooli.

cromatografia gazoasă cuplată cu spectroscopie de masă (GC/MS)

esterii au fost măsurați cu GC (HP 6890, Agilent, CA, SUA) echipat cu un MS (HP 5973, Agilent, ca, SUA). Pentru sistemul GC s-a utilizat coloana capilară Zebron ZB-5 (Phenomenex, CA, SUA) (30 m 0,25 mm 0,25 mm 0,25 mm) pentru separarea analiților, iar heliul a fost utilizat ca purtător cu un debit de 0,5 mL/min. Temperatura cuptorului program a fost stabilit după cum urmează: 50 °C temperatura inițială, 1 °C/min rampă de până la 58 °C, 25 °C/min rampă de până la 235 °C, 50 °C/min rampă de până la 300 °C, iar la 2 min se coace la 300 °C. 1 µL de eșantion hexadecane strat a fost injectat în coloană în splitless modul cu un injector temperatura de 280 °C. Pentru sistemul MS, modul ionic selectat (SIM) a fost utilizat pentru detectarea și cuantificarea esterilor cu următorii parametri: (i) acetat de etil, m/z 45,00 și 61,00 de la 4,2 la 4,6 min Timp de retenție (RT), (ii) acetat de izopropil, m/z 45 și 102 de la 4,7 la 5,0 min RT, (iii) acetat de propil, m/z 59 și 73 de la 5,2 la 5,8 min RT, (iv) izobutirat/z 73 și 116 de la 6,1 la 6,6 min rt, (v) acetat de izobutil, m/z 61 și 101 de la 6,6 la 7,6 min rt, (vi) acetat de butil, m/z 61 și 116 de la 7,7 la 9,2 min rt, (vii) izobutil izobutirat, m/z 89 și 129 de la 10,1 la 12.5 min RT, (viii) acetat de benzil, m/z 108 și 150 de la 13,1 la 13,8 min RT și (ix) acetat de 2-fenetil, m/z 104 și 121 de la 13,8 la 15,5 min RT. alcool izoamilic și acetat de izoamil au fost utilizate ca analiți standard interni. Esterii au fost identificați prin RT și cuantificați prin zonele de vârf și curbele standard. Curbele Standard au fost determinate folosind esteri Puri diluați în hexazecan la concentrații de 0,01 g / l, 0,05 g/L, 0,1 g/l, 0,5 g/l și 1 g/L.