microdeletia cromozomului Y la un tată și la cei patru fii infertili

rezumat

Microdeletiile Yq sunt asociate cu azoospermia și oligozoospermia severă. În general, bărbații cu ștergeri sunt infertili și, prin urmare, ștergerile nu sunt transmise fiilor decât dacă se efectuează fertilizarea in vitro (FIV) și injectarea intracitoplasmatică a spermei (ICSI). Raportăm o familie neobișnuită caracterizată de mai mulți membri cu infertilitate și microdeletie Yq. Istoricul complet al reproducerii, analizele de material seminal și probele de sânge au fost obținute de la membrii de familie relevanți. Pregătirea și cuantificarea ADN-ului au fost efectuate folosind kituri comerciale. Un total de 27 de perechi de seturi de grunduri bazate pe site-uri etichetate în secvență specifice locilor regiunii de microdeletie Y au fost utilizate pentru screening. Bloturile sudice care au fost șterse în azoospermie (DAZ) și motivul de legare ribozomală (RBM) CDN-uri au fost apoi analizate pentru confirmare. Probandul, cei trei frați și tatăl său s-au dovedit a fi șterși pentru DAZ, dar nu pentru RBM. La momentul analizei, tatăl probandului era azoospermic, în timp ce cei patru fii ai săi erau fie sever oligozoospermici, fie azoospermici. Spre deosebire de tatăl lor, cei patru fii sunt infertili și nu au descendenți, cu excepția unuia dintre ei care a obținut o fiică numai după tratamentul FIV/ICSI pentru infertilitate. Microdelețiile Yq care implică gena DAZ sunt asociate cu o expresie fenotipică variabilă care poate include fertilitatea evident normală.

Introducere

infertilitatea apare la ~14% dintre cupluri (Mosher, 1985) și se estimează că anomaliile partenerului de sex masculin sunt prezente în până la jumătate din cazuri (Swerdloff și colab., 1985). Eforturile de evaluare a cauzelor azoospermiei au arătat că după excluderea cauzelor recunoscute în mod tradițional (adică cariotip anormal, obstrucție, varicocoele, defect hormonal etc.), majoritatea cazurilor (50-75%) sunt inexplicabile și sunt denumite idiopatice (Pryor și colab., 1997). Recent, s-a raportat că până la 30% dintre bărbații cu azoospermie idiopatică au microdeleții ale cromozomului Y (Henegariu și colab., 1993; Ma și colab., 1993; Nagafuchi și colab., 1993; Kobayashi și colab., 1994; Najmabadi și colab., 1996; Reijo și colab., 1996; Vogt și colab., 1996; Pryor și colab., 1997). Exact cum și dacă aceste microdeleții provoacă sau nu azoo/oligozoospermie este subiectul atât al investigației intense, cât și al dezbaterii.

esențial pentru argumentul că microdelețiile y provoacă infertilitate este observația că bărbații fertili manifestă rareori microdeleții y. Au fost raportate microdeleții la patru din 200 de bărbați fertili studiați (Pryor și colab., 1997). Cu toate acestea, ștergerile la acești bărbați au fost foarte mici și cel mai probabil au reprezentat polimorfism nesemnificativ. La bărbații cu fertilitate normală nu au fost raportate deleții relativ mari de tipul celor asociate cu infertilitatea masculină. Deși se presupune, în general, că aceste ștergeri apar de novo și că transmiterea de la tată la fiu a microdeletiei Y nu ar fi de așteptat, au fost raportate câteva cazuri rare de transmitere de la tată la fiu a microdeletiei cromozomului Y (Kobayashi și colab., 1994; Stuppia și colab., 1996; Vogt și colab., 1996; Pryor și colab., 1997). Cu toate acestea, transmiterea verticală a unei microdeleții care implică locusul șters în azoospermie (DAZ) de la tată la un fiu a fost raportată în doar trei cazuri (Kobayashi și colab., 1994; Vogt și colab., 1996; Pryor și colab., 1997). Acum descriem o familie de patru generații în care un tată azoospermic și cei patru fii ai săi infertili împărtășesc toți o microdeletie aparent identică, care include locusul DAZ. Această familie reprezintă primul și singurul raport al transmiterii verticale spontane a ștergerii DAZ la mai mulți descendenți. Acesta oferă dovezi că o singură microdeletie Yq poate duce la diferite expresii fenotipice la diferiți indivizi. Este semnificativ din punct de vedere clinic, deoarece prezența unei microdeleții nu este un marker absolut pentru infertilitate și poate fi asociată cu fertilitatea aparent normală.

materiale și metode

screeningul pentru microdeletie Yq a fost efectuat pe o bază de rutină pentru infertilitatea masculină folosind un protocol revizuit și aprobat de Consiliul de revizuire Instituțională al Colegiului Medicilor & chirurgi, Universitatea Columbia. Probele au fost prelevate de la pacienți după consimțământul informat.

analiza materialului seminal

rezultatele au fost analizate utilizând criteriile OMS cu un microscop Nikon cu contrast de fază.

concentrațiile serice ale hormonului

hormonul foliculostimulant (FSH), hormonul luteinizant (LH) și testosteronul au fost măsurate prin testul imunometric al enzimei chemiluminescente în fază solidă (Immulite; Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, SUA). Intervalele normale pentru bărbați sunt FSH <10 mIU/ml; LH < 10 mIU/ml; și testosteron 270-1070 ng/dl.

ADN Genomic

extragerea ADN-ului genomic din sângele integral a fost efectuată prin Liza globulelor roșii, urmată de Liza globulelor albe și a nucleelor acestora. Proteinele celulare au fost îndepărtate prin precipitarea sării, iar ADN-ul genomic a fost precipitat cu izopropanol folosind kit de extracție a ADN-ului PUREGENE (Gentra Systems, Inc. Minneapolis, MN, Statele Unite ale Americii; catalog nr. D-5004).

reacția în lanț a polimerazei (PCR)

Primerii au fost produși ca oligonucleotide uscate pe un sintetizator automat de ADN (Perkin-Elmer Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, Statele Unite ale Americii). Un total de 27 de site-uri marcate cu secvențe specifice cromozomului Y (STS) (Figura 1) au fost selectate dintr-o hartă STS (Vollrath și colab., 1992). Acestea includ cele trei propuse spermatogeneza loci AZFa, AZFb, și AZFc (conform Vogt și colab., 1996) care acoperă intervalele Yq 5, 6 și 7. Ca protocol de screening rapid, un sistem multiplex PCR compus din două până la șase perechi de grunduri diferite a fost utilizat într-un total de șase reacții multiplexate (tabelul I). Cu fiecare alergare PCR, au fost incluse un control feminin și un control normal masculin. Toate reacțiile PCR au fost rulate în plăci din policarbonat (Techne XV) într-o mașină MJ research XV. Condițiile PCR au fost în esență așa cum au fost descrise anterior (Henegariu și colab., 1993). Pe scurt, într-o reacție cu volum total de 14 unql, 50 ng de ADN genomic a fost utilizat ca șablon, 1 unql de soluție standard de primer (amestecul I sau II sau III sau IV sau V sau VI constând din 10 pmol pe primer), 12 unql de `amestec rece PCR’ (1,5 mmol/l MgCl2, 0,2 mmol/l din fiecare dNTP, 5% DMSO, 1 unq tampon de reacție de polimerază Taq fără Mg2+), 1,25 UI ADN polimerază Taq (Promega) și 1 picătură de ulei. Amestecurile complete au fost plasate direct într-un termocicler preîncălzit la 94 C. condițiile de ciclism pentru 27 de cicluri au fost: 94 C, 30 s (topire); 55 C, 45 s (recoacere); și 72 C, 60 s (extensie). Timpul final de prelungire a fost de 5 min. Produsele de reacție PCR au fost apoi separate pe geluri de agaroză 3% (Bio-Rad, grad ultra-pur) prin electroforeză în tampon TBE. Produsele PCR au fost colorate cu bromură de etidiu și vizualizate prin expunerea la lumina ultravioletă. STS care nu prezintă amplificare în reacțiile multiplex au fost confirmate prin PCR cu reacție unică cu controale pozitive și negative adecvate. Un STS a fost considerat absent după trei eșecuri de amplificare.

hibridizarea sudică

sugerarea sudică a fost efectuată conform protocolului stabilit (Sambrook și colab., 1989). Pe scurt, 5 ADN-ul genomic de la 0,7% a fost digerat cu HindIII sau TaqI, rulat pe un gel de agaroză de 0,7% în tampon standard TBE, transferat într-o membrană de nailon și hibridizat cu sonde etichetate cu 32P. Sonda DAZ a fost inserția purificată a unei plasmide (pDP1577) care conține ADNc de lungime completă (Reijo și colab., 1995). În mod similar, sonda RBM a fost inserția plasmidă a unei clone RBM ADNc (MK5) (Ma și colab., 1993).

determinarea paternității

paternitatea tuturor celor patru fii a fost confirmată prin demonstrarea segregării așteptate a patru markeri autozomali foarte polimorfi (Weber și May, 1989). Acestea au fost D21S156, D21S270, D13S132 și D13S159 cu heterozigozități de 0,83, 0,86, 0,84 și, respectiv, 0,90.

hibridizare fluorescentă in situ (pește)

peștele pentru DAZ a fost efectuat cu Cosmid 63C9 (Saxena și colab., 1996), folosind metode stabilite (Yu și colab., 1996).

rezultate

probandul (individul III 8 din Figura 2) și soțul său (III-9) s-au prezentat la Clinica de reproducere-Endocrinologie-infertilitate de la Columbia-Presbyterian Medical Center cu plângere de infertilitate primară timp de 3 ani. Testarea a evidențiat cariotip normal și niveluri normale ale hormonilor serici, în timp ce analizele de spermă au arătat oligozoospermie severă (tabelul II). Screeningul de microdeletie prin PCR bazat pe STS a evidențiat prezența unei microdeleții în subintervalul 6D-6F al brațului lung al cromozomului Y (Figura 1). În timpul discuției, probandul a raportat că cei doi frați mai mari ai săi (III-4 și III-6) erau cunoscuți ca fiind azoospermici și infertili. Cercetările ulterioare au dezvăluit că toți cei trei frați aveau o microdeletie aparent identică. Biopsia testiculară efectuată pe unul dintre ei (III-6) a demonstrat sindromul `numai cu celule Sertoli’.

descoperirea microdeletiei la trei frati infertili a sugerat ca tatal lor avea probabil aceeasi stergere. A fost întreprins un studiu detaliat asupra restului familiei care locuia cu toții într-un mic oraș din Republica Dominicană. Un istoric complet de reproducere a fost obținut de la membrii adulți ai familiei. Relațiile familiale descrise în pedigree (Figura 2) au fost confirmate prin evidențierea segregării așteptate a mai multor markeri polimorfici autozomali (datele nu sunt prezentate) pentru membrii familiei relevanți (I-1, I-2, II-1, II-8 și II-1, II-2, III-1, III-4, III-6, III-8, III-10). Nu a existat nici o dovadă de non-paternitate. Studiile citogenetice aprofundate asupra membrilor de familie relevanți (I-1, II-1, II-6, II-8, II-10, III-1, III-4, III-6, III-8, III-14, III-15, III-17, III-19 și IV-1) au evidențiat cariotipuri normale. Analiza materialului seminal a fost efectuată la șapte din cei 16 bărbați, iar probele de sânge au fost obținute de la majoritatea membrilor familiei.

tabelul II rezumă rezultatele analizei materialului seminal și ale analizelor endocrine asupra membrilor de familie relevanți. Probandul (III-8), tatăl său (II-1) și doi dintre cei trei frați ai săi (III-4, III-6) s-au dovedit a fi fie azoospermic, fie sever oligozoospermic. Fratele mai mare al probandului (III-1) a refuzat analiza materialului seminal. În plus, unchiul probandului (II-8) sa dovedit a avea azoospermie și FSH crescut cu testosteron scăzut. După cum se arată în Figura 1, probandul, tatăl său și cei trei frați s-au dovedit a avea microdeletie de Yq prin analiza PCR STS. Southern blotting cu sondele DAZ (Figura 3) și RBM (datele nu sunt prezentate) au confirmat că ștergerea a inclus locusul DAZ, dar nu și locusul motivului de legare a ARN (RBM). Analiza peștilor cu Daz Cosmid 63C9 (Saxena și colab., 1996) din leucocitele tatălui probandului (II-1) au arătat absența uniformă a locusului DAZ (Figura 4).

constatarea că individul II-8 din pedigree era azoospermic, dar nu avea microdeletie a fost o surpriză. Locusul DAZ la acest individ a fost testat în continuare prin analiza sudică folosind ADNc DAZ și o enzimă de restricție diferită (TaqI). Nu a arătat nicio anomalie a locusului DAZ. În plus, peștii cu Daz Cosmid 63C9 au prezentat intensitate normală (datele nu sunt afișate).

probandul (III-8) și fratele său mai mare (III-6) căutau tratament pentru infertilitate. După consiliere extensivă, au optat pentru fertilizarea in vitro (FIV) și injectarea intracitoplasmatică a spermei (ICSI). Probandul (III-8) și soția sa (III-9) au suferit două cicluri IVF-ICSI care nu au reușit să producă o sarcină secundară răspunsului ovarian slab. Fratele probandului (III-6) și soția sa (III-7) au suferit un ciclu de hiperstimulare ovariană controlată și au fost recuperate nouă ovocite. Unsprezece spermatozoizi maturi au fost găsiți în trei ejaculate în ziua recuperării și utilizați pentru ICSI. Trei ovocite fertilizate care ulterior s-au scindat și au fost transferate. A născut un copil sănătos de sex feminin (IV-2).

discuție

raportăm o familie excepțională în care un tată azoospermic și cei patru fii ai săi infertili împărtășesc o microdeletie Yq aparent identică care implică locusul DAZ. Mutația de-novo care a dus la microdeletarea DAZ pare să fi provenit din Tatăl probandului (II-1). Se așteaptă ca această ștergere să provoace azoo/oligozoospermie și infertilitate masculină și totuși a conceput spontan cinci copii și nu a fost conștient de nicio problemă de fertilitate. Interesant, totuși, toți cei patru fii sunt infertili și sunt fie azoospermici, fie sever oligozoospermici.

această familie ridică mai multe probleme în ceea ce privește asocierea dintre microdeletia Yq și infertilitate. În primul rând, confirmă faptul că transmiterea verticală a Microdeletiei Yq este posibilă și poate duce la infertilitate ulterioară la descendenții masculi. În al doilea rând, este evident că aceeași ștergere poate duce la fenotipuri diferite la indivizi diferiți. Deși tatăl (II-1) al celor patru băieți din această familie era azoospermic la momentul analizei, el a născut primul său copil la vârsta de 25 de ani și ultimul său la vârsta de 38 de ani. Astfel, el a posedat un anumit grad de fertilitate pe o perioadă mare de ani. La fel, microdeletarea cromozomului Y, în special DAZ, nu implică neapărat o istorie de azoospermie pe tot parcursul vieții și nici nu împiedică formarea unei familii numeroase. Cei patru fii ai săi, pe de altă parte, sunt infertili și fie azoospermici, fie sever oligozoospermici.

gena DAZ a fost propusă ca factor de azoospermie pe cromozomul Y. Această familie arată clar că, deși DAZ poate avea un rol critic în spermatogeneză, nu este esențial pentru fertilitate. În plus, pierderea totală a grupului de gene DAZ poate fi asociată cu o imagine histologică a `numai a celulelor Sertoli’, precum și cu stoparea maturării spermei (Foresta și colab., 1997; Pryor și colab., 1997). Mai mulți autori au găsit o corelație slabă între localizarea microdeleților Y (inclusiv ștergerile DAZ) cu fenotipul clinic și histologic al pacienților (Reijo și colab., 1995, 1996; Vogt și colab.; 1996; Silber și colab., 1998). Constatările din această familie sunt de acord că o astfel de corelație se poate dovedi a fi destul de problematică. Biopsia testiculară a fratelui probandului (III-6) a arătat o imagine a `numai a celulei Sertoli’, în timp ce probandul (III-8 cu număr de spermatozoizi 0,5 106/ml) ar fi în mod clar de așteptat să aibă un anumit grad de maturare a spermei la biopsie. Mai mult, biopsia testiculară poate să nu fie reprezentativă pentru întregul testicul, deoarece poate exista o eterogenitate geografică pentru spermatogeneză ca la individul III-6 ale cărui ejaculări conțineau spermatozoizi maturi.

putem specula doar despre baza diferențelor fenotipice dintre membrii familiei cu aceeași ștergere. Este bine cunoscut faptul că ștergerile identice din cadrul autozomilor pot duce la fenotipuri diferite (Schinzel, 1994). Se poate postula că astfel de diferențe sunt consecințe ale expunerii fiecărui individ la mediul său sau expresia diferitelor gene modificatoare. Un tată fertil a fost descris cu o microdeletie care s-a lărgit atunci când a fost transmis fiului său infertil (Stuppia și colab., 1996). Deși extensiile variabile la granițele ștergerii pot exista între diferiții noștri membri ai familiei, aceste extensii moleculare nu pot fi distinse prin maparea intervalelor. Prin analiza PCR, același STSs nu a reușit să se amplifice la cei cinci indivizi, iar hibridizarea sudică cu sonda DAZ a confirmat o ștergere completă a acestui grup de gene. Deși este posibil ca ștergerile observate să nu fie, de fapt, identice, iar zonele adiacente pot conține gene importante care modulează gradul de Expresie fenotipică, aceste rezultate indică încă o suprapunere mare a ADN-ului y șters (inclusiv pierderea clusterului de gene DAZ) la fiecare individ din această familie unică.

am fost fascinați de faptul că unchiul probandului (II-8) are infertilitate și azoospermie, dar nu există microdeletie aparentă prin testarea STS. Deoarece analiza Southern blot folosind atât sondele RBM și DAZ, cât și analizele de pește folosind un cosmid DAZ au fost toate în întregime normale, suntem obligați să concluzionăm că are o etiologie diferită care stă la baza infertilității sale. Desigur, este posibil ca el să aibă o mutație/perturbare mai mică sau punctuală sau o rearanjare proximală/distală care nu este detectabilă prin metodele curente. El nu a dat antecedente de expunere la gonadotoxine sau la alți factori definibili care ar putea afecta spermatogeneza.

până de curând, y microdeletie a avut o semnificație clinică redusă, deoarece un om cu o ștergere nu se va reproduce, în general. Cu toate acestea, utilizând ICSI și aspirația spermei testiculare (TESA), combinată cu FIV, acum este posibil ca bărbații oligo/azoospermici cu microdeletie Y să realizeze sarcini (Mulhall și colab., 1997; Silber și colab., 1998 și individual III-6). Acest lucru a stimulat îngrijorarea că astfel de sarcini pot produce descendenți masculi cu microdeleții similare și infertilitate ulterioară (Reijo și colab., 1996; Girardi și colab., 1997; Kremer și colab., 1997). Într-adevăr, microdeletia Yq poate fi transmisă descendenților masculi prin ICSI (Kent-First și colab., 1996). Familia pe care o raportăm sugerează că bărbații cu microdeleții Yq (cum ar fi individul II-1) care realizează sarcini vor transmite aceeași microdeleție și riscul de infertilitate fiilor lor (indivizii III-1, III-4, III-6, III-8). Prin urmare, pacienților trebuie să li se ofere screening pentru microdeletie y înainte de ICSI și trebuie consiliați cu privire la certitudinea transmiterii microdeletiei Yq și, eventual, a infertilității fiilor lor. Deoarece mai multe cercetări se concentrează pe etiologiile genetice ale infertilității masculine, identificarea genelor implicate în spermatogeneză ar trebui să ofere o perspectivă asupra fiziopatologiei infertilității masculine și o bază mai rațională pentru inițierea terapiei.

mulțumim familiilor pentru cooperarea lor în studiu; Dr. David C. Page pentru furnizarea sondei ADNc DAZ și ajutorul său neprețuit cu acest manuscris; Dr. kun Ma pentru furnizarea sondei ADNc MK5 (RBM1) ; Dr. Peter Vogt pentru ADN-ul persoanelor Microdeletate Yq utilizate pentru a valida metodologia noastră PCR STS; și C. C. Yu și Patricia Lanzano pentru asistența tehnică neprețuită.

acest studiu a fost finanțat parțial de Columbia Presbyterian Medical Center Office of Clinical Trials house Staff Awards.