mecanismele de rearanjare cromozomială în genomul uman

DSB patologice sunt definite în mod arbitrar ca DSB care nu servesc nici unui scop fiziologic și pot duce la disfuncții celulare.

ADN Aleatoriu se rupe din cauza radiațiilor ionizante sau a radicalilor liberi oxidativi

în multe rearanjări cromozomiale, DSB-urile la una sau ambele gene par a fi localizate aleatoriu în regiuni mari de multe kilobaze. Poziționarea aleatorie și lipsa aparentă a tendinței secvenței sunt sugestive pentru mecanismele DSB nespecifice secvenței, cum ar fi radicalii liberi oxidativi, radiațiile ionizante sau, mai puțin frecvent, hidroliza spontană a coloanei vertebrale a ADN-ului.

aproximativ jumătate din radiațiile ionizante naturale ale mediului provin din metale grele naturale ale pământului, cum ar fi uraniul, toriul și chiar potasiul. Cealaltă jumătate a radiației ionizante emană din radiația cosmică care nu este complet blocată de atmosferă. În total, aproximativ 3 x 108 particule de radiații ionizante trec prin fiecare dintre noi în fiecare oră , producând radicali liberi hidroxil din apă în urma lor. Acest tract de radicali liberi hidroxil provoacă deteriorarea clusterului asupra ADN-ului, rupând astfel ambele fire de ADN.

aproximativ 0,1% din oxigenul pe care îl respirăm este transformat în radicali liberi . Acest lucru generează 3 x1022 radicali liberi pe oră în fiecare dintre noi, iar acești radicali liberi dăunători sunt distribuiți în cele 1014 celule ale corpului uman. Radicalii liberi provoacă predominant deteriorarea ADN-ului cu o singură catenă, dar două astfel de evenimente din apropiere pot duce la un DSB.

acțiune RAG la site-uri RSS criptice în locații în afara țintei într-o manieră specifică secvenței: v(D)pauze de tip J

secvența de consens RSS HEPTAMER/nonamer nu este în niciun caz unică pentru locii Ig și TCR, iar complexul RAG poate tăia la site-uri care diferă substanțial de consensul 16 bp . Motivul minim pentru zgârierea cârpei este doar CAC. Astfel, complexul RAG poate acționa la site-uri locus ale receptorului non-antigen asemănător RSS, denumit RSS criptic (cRSS). Acest lucru apare în multe dintre rearanjamentele observate în limfomul limfoblastic acut cu celule T umane . În aceste cazuri, în loc de complexul RAG care împerechează un 12-RSS cu un 23-RSS, un 12-RSS se împerechează cu un 23-cRSS sau un 23-RSS perechi cu un 12-cRSS. Numim aceste pauze v(D)pauze de tip J, deoarece acestea apar prin același mecanism ca și recombinarea normală V (D)J, indiferent de faptul că unul dintre site-uri se află în afara locilor obișnuiți ai receptorului antigenului (adică este în afara țintei).

acțiune RAG la structurile cu bule ADN și alte regiuni ale heterologiei într-o manieră specifică structurii

în plus față de modul său de tăiere specific secvenței, complexul RAG poate, de asemenea, nick într-o manieră specifică structurii la locurile de tranziție de la dsDNA la ssDNA, cum ar fi apare la marginile structurilor ADN cu bule sau chiar nepotriviri cu o singură bază . O astfel de activitate a complexului de cârpe ar fi putut apărea deoarece complexul de cârpe este obișnuit să creeze structuri de ac de păr, ceea ce implică o distorsiune substanțială a ADN-ului. Prin urmare, orice regiune de nepotrivire sau alunecare este o țintă potențială pentru lovirea de către complexul RAG din celulele limfoide.

transpunerea mediată de RAG ca mecanism de rearanjare cromozomială

din 1998 până în 2007, mai multe laboratoare au propus ca complexul RAG să introducă capetele contondente care conțin RSS din recombinarea V(D)J, denumite capete de semnal, în noi locații din genom. Aceasta se numește transpunere de cârpă și are loc la un nivel scăzut folosind o formă trunchiată a proteinelor de cârpă numite cârpe de bază (revizuite în ). Cu toate acestea, eforturile de a găsi evenimente de transpunere a RAG in vivo au arătat că acestea au fost mult mai puțin frecvente decât integrarea aleatorie a ADN-ului . În cele din urmă, nu există exemple de malignități limfoide umane (sau orice alt tip de malignitate) în care genomul a fost modificat printr-o inserție transpozițională RAG a capetelor semnalului (sau orice altă variantă aparentă a unei astfel de transpuneri).

acțiune de ajutor în locații în afara țintei

după cum s-a menționat în discuția de mai sus privind recombinarea comutatorului de clasă, ajutorul poate converti C în U sau metil C sau T în orice regiune a ADNc. Acest lucru pare să apară nu numai la secvențele de comutare și domeniile variabile ale locilor Ig, ci și la unele locații patologice, cum ar fi unele oncogene precum c-myc . Atunci când sunt vizate de ajutor, aceste regiuni pot susține mutații punctuale sau DSBs . Acțiunea de ajutor în regiunea de comutare IgH în timpul CSR și acțiunea de ajutor independentă la gena c-myc pentru a crea un DSB se consideră a fi baza celor două DSB inițiatoare atât în translocațiile c-myc la șoarece, cât și la om . S-ar putea considera pauzele de acest tip ca pauze de tip CSR (așa cum s-a menționat mai sus în discuția recombinării comutatorului de clasă) sau pauze de tip SHM, unde SHM se referă la evenimente inițiate de ajutor de tip similar cu ceea ce apare în mod normal în hipermutația somatică.

acțiune combinată presupusă a ajutorului și RAGs la locurile CpG: pauzele de tip CpG

recent, am raportat că DSBs la anumite loci în translocațiile etapei pro-B/pre-B-bcl – 2 din t(14;18), bcl-1 din t(11;14) și E2A din t(1;19)-au o tendință puternică de a apărea la secvența dinucleotidă CpG.

translocarea bcl-2 este cea mai frecventă translocare în cancer, apărând în > 90% din limfoamele foliculare și o treime din limfoamele difuze cu celule mari. Cincizeci la sută din pauzele la gena bcl-2 apar în regiunea punctului de întrerupere major (MBR), care este un hotspot de 175 bp în 3′ cel mai exon din regiunea care codifică 3 ‘ UTR. Două puncte fierbinți mai puțin utilizate sunt situate la 18 și 29 kb mai departe distal de gena bcl-2, Regiunea clusterului intermediar bcl-2 de 105 bp (icr) și, respectiv, Regiunea clusterului minor bcl-2 de 561 BP (mcr). Oricare dintre site-urile CpG din oricare dintre aceste trei zone de translocare bcl-2 poate fi o țintă pentru un DSB . Treisprezece la sută din pauzele de translocare bcl-2 sunt localizate în icr și 5% în mcr.

utilizarea CpGs se aplică și clusterului de translocare majoră bcl-1, Care este locația implicată în translocarea t(11;14). Translocația bcl-1 apare în aproape toate limfoamele cu celule de manta, cu 30% din pauze care apar la clusterul de translocație majoră bcl-1 de 150 bp (MTC).

pauzele de tip CpG apar, de asemenea, într – o a treia malignitate limfoidă, t(1;19) într-un procent mic de pre-B ALLs, o translocare care are loc între gena Pbx1 și gena E2A. Pauzele la gena E2A apar într-o zonă de numai 23 bp, iar aceste DSB sunt, de asemenea, grupate semnificativ în jurul siturilor CpG . Toate cele trei translocații care implică bcl-2, bcl-1 și E2A apar în stadiul pro-B/pre-B al dezvoltării celulelor B.

bcl-2 MBR este reactiv cu o sondă chimică pentru o singură strandedness numită bisulfit . La fel ca bcl-2 MBR, acest bcl-1 MTC este relativ mic (150 bp) și prezintă o reactivitate similară cu bisulfitul . Aceste zone reactive foarte bisulfite sunt bogate în serii de Cs. Bazat pe dicroism circular, cristalografie cu raze X, RMN, și sondare chimică, astfel de rulări de Cs tind să adopte o structură ADN care este intermediară între ADN-ul formei B și ADN-ul formei a, denumit B/a-intermediar . Structura intermediară B / A are o cinetică de deschidere mai rapidă, reprezentând probabil o parte din creșterea observată a reactivității bisulfitului. Astfel de regiuni neobișnuite ale ADN-ului pot fi mai predispuse la evenimente de alunecare, probabil induse de replicarea sau transcripția ADN-ului. Acest lucru poate explica apoi vulnerabilitatea lor în testele de recombinare minichromozomală .

Cs al CPG-urilor din interiorul sau direct adiacent acestor zone intermediare B/A prezintă un risc crescut de a fi supuse dezaminării . Această dezaminare nu se aplică tuturor Cs din regiune, ci doar Cs care se află în siturile CpG. Singura caracteristică distinctivă a unui astfel de Cs în cadrul CpGs este că acestea pot fi metilate de ADN metiltransferază. Când Cs regulat se dezaminează, ele devin U, rezultând o nepotrivire U:G. Dar când metil Cs deaminat, ele devin T, rezultând o nepotrivire T:G. Repararea nepotrivirilor U: G este foarte eficientă, dar repararea nepotrivirilor T:G nu este eficientă. De fapt, repararea nepotrivirii T:G este atât de ineficientă, încât reprezintă aproximativ jumătate din mutațiile punctuale ale genei p53 într-o gamă largă de cancere umane. Aceste site-uri de nepotrivire T:G sunt întotdeauna la site-urile CpG.

ce cauzează ruperea la aceste site-uri de nepotrivire T:G? Interesant este că această dezaminare la aceste puncte fierbinți de translocare limfoidă pare să apară în stadiul pre-B de diferențiere. Aceasta este etapa de dezvoltare a celulelor B atunci când recombinarea de la D la J are loc cel mai puternic. Deoarece translocațiile bcl-2 și bcl-1 apar în acest stadiu, acest lucru pare probabil să fie stadiul translocării. Am arătat că complexul RAG poate provoca un DSB la site-urile de structuri cu bule mici și chiar nepotriviri cu o singură pereche de baze. (După cum sa menționat mai sus, această acțiune a complexului RAG reflectă activitatea nucleazei specifice structurii sale, poate o caracteristică care reflectă acțiunile specifice structurii complexului RAG în timpul etapei de formare a acului de păr v(D)j recombinare.) Prin urmare, am propus ca complexul RAG să facă DSB-urile la locurile de nepotrivire T:G.

dacă complexul RAG provoacă DSB – urile la site-urile CpG, atunci de ce nu apar astfel de pauze de tip CpG în celulele pre-T, care exprimă și complexul enzimatic RAG? Linia celulei B exprimă o citidină deaminază pentru recombinarea comutatorului de clasă și hipermutația somatică. După cum sa menționat mai sus, această enzimă se numește deaminază indusă de activare (AID). Ajutorul este exprimat în celulele B, dar nu și în alte celule somatice. Ajutorul este cel mai puternic exprimat în celulele B atunci când se află în centrele germinale. Cu toate acestea, un nivel scăzut de exprimare a ajutorului a fost descris în celulele pre-B. Mai mult decât atât, celulele B care părăsesc măduva osoasă, numite celule B de tranziție, de asemenea, se crede că exprimă ajutor . Prin urmare, există o perioadă de timp în care celulele B completează recombinarea V(D)J și încep să exprime ajutor atunci când atât ajutorul, cât și complexul RAG sunt prezente în celulele B. S-a dovedit că AID este capabil să deamineze metil C la T. Prin urmare, propunem că AID este probabil responsabil pentru mutația meC la T la locurile CpG din celulele B timpurii. Nepotrivirea t:G rezultată este apoi tăiată de complexul RAG, rezultând un DSB. Acest model explică trei vârfuri de translocare situate în cadrul bcl-2 MBR, toate fiind centrate pe site-urile CpG .

alte cauze ale DSBs patologice cu mecanism necunoscut

anumite translocații sunt puternic asociate cu terapia cu inhibitor de topoiziomerază de tip II . După o astfel de terapie, unii pacienți dezvoltă malignități secundare cu aceste translocații caracteristice. Topoizomerazele, în general, fac pauze cu o singură sau dublă catenă pentru a înfășura sau desface ADN – ul, astfel au o activitate nucleazică ca parte a funcției lor. După înfășurarea sau desfacerea ADN-ului, acestea resigilează în mod normal ruperea(rupturile). S-a propus că întreruperea sau prevenirea resigilării poate duce la pauze stabile observate în rearanjările cromozomiale .

unele DSB-uri apar la site-uri din apropiere directe sau inversate ADN-ul se repetă. Astfel de repetări pot da naștere unor structuri ADN alunecate care conțin regiuni de ADN monocatenar, care pot fi ținte pentru clivaj. Cel mai bun exemplu în acest sens este translocația Constituțională t(11;22)(q23;q11), care conține un palindrom bogat în AT de câteva sute de baze, cu potențial de formare cruciformă.

combinație de mecanisme DSB multiple într-o rearanjare

având în vedere că două DSB-uri sunt necesare pentru a genera o translocație, cele două pauze nu sunt adesea legate între ele. În translocațiile bcl-2 și bcl-1, de exemplu, pauza la locusul IgH este o pauză de tip V(D)J generată de acțiunea specifică secvenței complexului RAG în timpul recombinării V(D)J. (S-ar putea considera că acesta este un eșec în finalizarea procesului normal de recombinare V(D)J.) DSB la locusul bcl-2 sau bcl-1 este o pauză de tip CpG care s-a propus a fi datorată acțiunii secvențiale a ajutorului și activității de tăiere specifice structurii complexului RAG .

chiar și într-un locus dat, poate exista o gamă largă de mecanisme DSB. Locii SCL și LMO2 susțin predominant ambele DSB-uri de tip V(D)J, dar o treime sau mai multe dintre DSB-uri sunt incompatibile cu cerințele de secvență pentru DSB-urile de tip V(D)J, iar acestea se pot datora deteriorării radicalilor liberi, radiațiilor ionizante sau eșecurilor topoizomerazei. Loci diferiți într-o singură celulă sunt, prin urmare, predispuși la diferite tipuri de mecanisme DSB.

DSB induse de replicare

în timpul replicării ADN-ului, ștergerile pot apărea din cauza alunecării catenei de sinteză pe catena șablonului. Rearanjările cromozomiale care apar la anumite puncte fierbinți, fie în cancerul celulelor somatice, fie în timpul gametogenezei/diviziunilor inițiale de dezvoltare ca translocații constituționale, se numesc translocații recurente care pot fi văzute la mulți pacienți. Translocațiile nerecurente sunt cele care apar în locații diferite de la un pacient la altul, dar Modifică sau inactivează o genă care provoacă o boală. Spre deosebire de translocațiile recurente pe care le-am discutat în cancerul de mai sus, mecanismele care determină schimbul de fire în translocațiile nerecurente par să implice comutarea șabloanelor în timpul sintezei ADN replicative. Aceste comutatoare șablon pot apărea în regiuni mici ale omologiei secvenței ADN, cum ar fi 5 bp. Această comutare a șablonului a fost numită replicare indusă de rupere mediată de microhomologie (MMBIR) sau blocarea furcii și comutarea șablonului (FoSTeS). Pentru joncțiunile de translocare nerecurente care implică mai multe întinderi lungi de secvență din regiuni ale genomului care sunt în mod normal separate una de cealaltă, evenimente multiple de comutare a șabloanelor a fost propus ca mecanism .