măsurarea comparativă a CNP și nt-proCNP în probele de sânge uman: o evaluare metodologică

Introducere

peptidă natriuretică de tip C (CNP), identificată în 1990 de Sudoh și colab., este cel mai vechi membru al familiei peptidelor natriuretice . CNP stimulează selectiv receptorul peptidic natriuretic uman 2 (NPR2), care activează kinaza dependentă de cGMP (cGK) prin creșterea concentrației intracelulare de cGMP . În plus, CNP leagă NPR3 și, la rândul său, dezactivează protein kinaza a prin inhibarea dependentă de proteina Gi a adenilat ciclazei . CNP are proprietăți anti-proliferative și anti-migratoare și a fost, de asemenea, identificat ca un factor de relaxare derivat din endoteliu . Mai mult, CNP inhibă restenoza neointimală, reduce remodelarea constrictivă vasculară și leziunea ischemică-reperfuzie cardiacă . CNP joacă un rol important în creșterea osoasă, reproducere, creșterea nervilor, re-endotelializare, precum și funcția renală, pancreatică și cardiacă . În plus, CNP a fost recent recunoscut ca fiind implicat în dezvoltarea formării plăcii aterosclerotice .

datorită multitudinii de funcții CNP, această peptidă a atins un interes tot mai mare în cercetarea cardiovasculară în ultimii ani. Cu toate acestea, studiile privind concentrațiile de CNP în probele de sânge sunt inconsistente. Unele dintre aceste studii au măsurat concentrațiile de CNP sau pro-peptida sa amino-terminală (nt-proCNP) în probele de ser, iar altele au utilizat probe de plasmă . Din păcate, detaliile privind întârzierile potențiale în timpul prelevării de probe de sânge și prelucrarea ulterioară a probelor nu au fost încă raportate. În literatura de specialitate disponibilă până în prezent, nu există date privind diferența dintre concentrațiile de CNP/nt-proCNP între probele serice și cele plasmatice. De asemenea, influența întârzierii procesării probelor de sânge rămâne neclară. În plus, concentrația CNP în probele serice și plasmatice a variat semnificativ (Tabelul 1). Prin urmare, scopul acestui studiu a fost de a răspunde la următoarele întrebări metodologice: (1) procesarea întârziată a probelor de sânge depozitate la temperatura camerei provoacă părtinire? (2) există vreo diferență între concentrațiile serice și cele plasmatice ale CNP sau nt-proCNP? (3) sunt aceste diferențe dependente de timp?

metode

am studiat 12 voluntari de sex masculin (vârsta medie 29 2 ani, greutate normală, fără terapie medicamentoasă, fără antecedente de boli cardiovasculare sau de altă natură, 3 fumători). De la toți subiecții investigați a fost obținut consimțământul informat. Triplete de probe de sânge De Post au fost prelevate de la toți voluntarii la ora 8 dimineața. Probele de sânge au fost prelevate utilizând sistemul de colectare s-monovette 7,5 ml (Sarstedt, n Xixtbrecht, Germania) conținând fie activator de coagulare (caolin) pentru probe de ser, citrat de sodiu pentru probe de plasmă, fie EDTA de potasiu pentru probe complete de sânge. Toate probele pentru analizele inițiale au fost centrifugate imediat la 2.000 de grame la sută timp de 10 minute la 4 cenți la sută și supernatantul a fost depozitat la -70 cenți la sută până la analiză. Pentru analize la jumătatea perioadei (30 minute sau 2 ore), probele de plasmă au fost centrifugate la 2000 de centi g timp de 10 minute la temperatura camerei. Supernatantul a fost îndepărtat și păstrat la temperatura camerei timp de 30 min sau 2 ore. După coagularea sângelui, probele de ser au fost prelucrate identic cu probele de plasmă. Supernatantul a fost păstrat și, de asemenea, păstrat la temperatura camerei timp de 30 min sau 2 ore. Probele complete de sânge au fost depozitate la temperatura camerei fără centrifugare. După 30 min sau 2 ore, probele complete de sânge au fost centrifugate la 2.000 XTX g timp de 10 min la 4 XTX C. supernatantul a fost îndepărtat și depozitat la -70 XTX C până la analiză. Concentrația de CNP a fost măsurată folosind kitul CNP-22 EIA (#EK-012-03, Phoenix Pharmaceuticals, Karlsruhe, Germania) conform protocolului producătorului. Concentrația nt-proCNP a fost măsurată folosind kitul NT-proCNP EIA (Biomedica, Viena, Austria) conform protocolului producătorului. ANOVA unidirecțională a fost utilizată pentru compararea grupurilor. Pentru comparații în perechi, a fost aplicat testul T. Datele sunt prezentate ca mijloc de deviație standard (SD) sau interval de încredere de 95% (95%-IÎ). Semnificația statistică a fost asumată la p < 0,05. Datele au fost analizate cu ajutorul MedCalc pentru Windows, versiunea 10.0.1.0 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgia).

rezultate

așa cum se arată în figura 1a, concentrațiile inițiale ale CNP în probele serice, plasmatice și complete de sânge au fost de 0,997 0,379 ng/ml, 1,933 0,699 ng/ml, respectiv 0,991 0,489 ng/ml. Concentrațiile plasmatice ale CNP au fost semnificativ mai mari comparativ cu probele serice și complete de sânge la toate momentele de timp (ANOVA, p = 0, 001 la momentul inițial, p < 0, 001 la 30′ min. și p = 0,003 la 120 ‘ min.). Nu s-a observat nicio diferență semnificativă între probele serice și cele complete de sânge în orice moment (ANOVA, p > 0, 05). Concentrațiile inițiale ale nt-proCNP în probele serice, plasmatice și complete de sânge au fost de 58,5 int 28,3 pg/ml, 60,3 int 23,9 pg/ml și, respectiv, 50,7 int 21,4 pg/ml (figura 1b). Nu s-a constatat nicio diferență semnificativă între grupuri în orice moment (ANOVA, p > 0,05). În probele complete de sânge, concentrația de lactat a crescut semnificativ după 2 ore comparativ cu valoarea inițială (3,2 0,8 mm, 0,0 0,6 mm, p < 0,001). În plus, valoarea pH-ului a scăzut de la 7.34 0.03 la momentul inițial până la 7, 29 0, 03 după 2 ore (p < 0, 001).

discuție

studiul nostru a arătat că CNP și nt-proCNP sunt stabile în ser și în probe complete de sânge timp de cel puțin două ore la temperatura camerei. În consecință, stabilitatea peptidei CNP nu este cel mai probabil afectată de nicio întârziere în procesarea probelor timp de cel puțin două ore. ProCNP a fost deja raportat (protocolul producătorului, condiții necunoscute de păstrare a probelor de sânge) să fie stabil timp de cel puțin 2,5 ore. În consecință, experimentele noastre au confirmat stabilitatea nt-proCNP chiar și la temperatura camerei. Concentrația de nt-proCNP în toate tipurile de probe a rămas constantă pe parcursul timpului timp de până la 2 ore, indicând stabilitatea pe termen lung a acestei proteine. Astfel cum sunt enumerate în tabelul 1, concentrația medie a nt-proCNP(56,5 inkt 24.3 pg/ml) măsurate în acest studiu s-au încadrat în intervalul raportat (vezi Tabelul 1) la persoanele sănătoase (3,7-432 pg/ml).

spre deosebire de nt-proCNP, concentrația de CNP a fost semnificativ mai mare în probele plasmatice comparativ cu probele serice și complete de sânge (Figura 1). Până în prezent, nici grupul nostru, nici serviciul tehnic al producătorilor nu au găsit dovezi privind influența tipului de eșantion asupra testului ELISA utilizat în acest studiu. Cu toate acestea, la momentul inițial, supernatantul plasmatic și probele complete de sânge au fost identice, cu excepția tipului de inhibitor de coagulare a sângelui utilizat. Acest inhibitor a fost citratul de sodiu în grupul plasmatic și EDTA în grupul complet de probe de sânge. Probele complete de sânge au evidențiat rezultate comparabile cu probele serice (p = 0,98). Prin urmare, este foarte probabil ca citratul de sodiu să influențeze semnificativ concentrația măsurată de CNP în plasmă și, prin urmare, să falsifice rezultatele obținute prin această tehnică.

în mod neașteptat, concentrațiile inițiale ale CNP atât în probele plasmatice, cât și în cele serice au fost de aproximativ o mie de ori mai mari decât în alte rapoarte (Tabelul 1) . În toate aceste studii, testul radioimunologic (Ria-Kit) a fost utilizat pentru determinarea concentrațiilor de CNP. În schimb, în alte două studii concentrațiile CNP măsurate în probele serice și plasmatice au fost comparabile cu rezultatele noastre în ceea ce privește mărimea dimensiunii . Interesant, în ultimele studii, același Kit ELISA a fost folosit ca în ancheta noastră. Chiar și după o evaluare extensivă a diferiților factori interni și externi, nu a putut fi găsită nicio explicație satisfăcută a acestei discrepanțe. Măsurătorile de Control utilizând CNP exogen în serul uman au evidențiat o eroare de măsurare nesemnificativă de +7,8% (95% –KI: -). Peptida CNP utilizată pentru curba de referință a fost sintetizată chiar de Producător (Phoenix). În schimb, peptida CNP utilizată ca control” exogen ” a fost furnizată de Bachem. După cum au asigurat ambii producători, secvențele de aminoacizi au fost identice și s-au format legături disulfidice în ambele peptide.

cu toate acestea, rezultatele măsurătorilor controlului intern pot fi rezumate după cum urmează: În primul rând, măsurătorile de control efectuate în studiul nostru au arătat că kiturile ELISA au fost utilizate corect, în conformitate cu instrucțiunile producătorului. În al doilea rând, măsurătorile utilizând eșantioane de control au confirmat adecvarea curbei standard aplicate. În al treilea rând, probele de ser de control care conțin CNP exogen au evidențiat o precizie acceptabilă, iar rezultatele au fost în ordinea de mărime așteptată. În al patrulea rând, o concentrație mai mare de CNP în probele de plasmă este cel mai probabil un artefact cauzat de citratul de sodiu.

după cum au raportat Clerico și colegii de muncă, sunt cunoscute, de asemenea, diferențe comparabile de rezultate între diferitele metode RIA și EIA, de exemplu, ANP și BNP . Clerico și colegii săi au concluzionat că diferențele mari în aceste rezultate se datorează cel mai probabil specificității anticorpilor monoclonali sau policlonali utilizați, proiectării sistemului imunotest (test competitiv vs .necompetitiv), matricei analitice (ser vs. EDTA vs. plasmă heparinizată) utilizată și multitudinii de forme circulante de peptide natriuretice, așa cum s-a raportat anterior pentru imunotestele ANP și BNP. Aceste surse metodologice de părtinire pot fi, de asemenea, concepute pentru testele CNP și nt-proCNP și explică astfel marea diferență de rezultate în studiile citate (Tabelul 1).

Limitările studiului

recunoaștem că o dimensiune a eșantionului de 12 este prea mică pentru a concluziona că nu există nicio diferență. Cu toate acestea, din punct de vedere statistic, ar fi important să se precizeze cât de mare trebuie să fie diferența pentru a avea relevanță medicală. Din cunoștințele noastre, acesta din urmă nu este încă clar definit. Prin urmare, mijloacele și intervalele de încredere de 95% ale tuturor măsurilor au fost date în figură pentru a permite fiecărui cititor să-și tragă propria interpretare și din date.

în ceea ce privește concentrațiile serice și plasmatice, trebuie menționat faptul că valorile raportate în tabelul 1 au fost măsurate prin metode diferite (RIA, ELISA) la pacienții care suferă de diferite boli. Ar fi fost foarte util să comparăm CNP-RIA cu testele CNP-ELISA direct folosind aceleași specimene, deoarece o diferență de o mie de ori în ordinea mărimii rămâne vizibilă. Din păcate, măsurătorile testelor RIA nu au fost disponibile în laboratorul nostru. Pentru concentrația NT-proCNP, această din urmă comparație a fost investigată de Olney și colegii săi, arătând că Elisa comercială (Biomedica Medizinprodukte GmbH & Co KG, Viena, Austria) a dat valori care au fost în medie de 21% (interval 11-52%) din valorile RIA. Validarea încrucișată a standardului de referință al kitului ELISA utilizând testul RIA a arătat un dezacord de 15% .

rezumat

măsurătorile CNP și nt-proCNP au fost cel mai probabil neafectate de întârzierea procesării probelor sau a tipului de probă de sânge (cu excepția CNP în probele de plasmă). Pentru probele de plasmă, numai probele de sânge anticoagulant EDTA au fost adecvate pentru testul ELISA CNP utilizat în acest studiu. În consecință, concentrația de CNP și nt-proCNP ar putea fi utilizată în aplicații clinice pentru a determina efectele CNP. De asemenea, trebuie să se considere că concentrația de nt-proCNP, fiind doar un produs secundar al peptidei active, poate ascunde adevărata natură a CNP. Cu toate acestea, discrepanța în concentrațiile CNP măsurate determinate fie prin teste RIA, fie prin teste ELISA rămâne încă inexplicabilă, dar pare cel mai probabil să se datoreze unor probleme metodologice. Prin urmare , așa cum se recomandă pentru ANP și BNP, testele imunologice pentru CNP trebuie, de asemenea, să fie standardizate sau armonizate în viitor.