Himere

ce veți furniza Partea I

• un număr de cont.
• o linie de celule ES fără micoplasme cu 40 de cromozomi.

ce vom face

• vom injecta aproximativ 50 de blastociste pe linia de celule ES. Acest lucru ar trebui să ducă la nașterea a 10 șoareci. Se așteaptă ca trei dintre șoareci să fie himere masculine puternice. Avem un record dovedit de succes.
• vom găzdui șoarecii până la înțărcare (la trei săptămâni după naștere).

ce veți oferi Partea a II-a

• veți găzdui șoarecii înțărcați.

Cost

• 3.300 USD pe 129 linie celulară și costul femelelor donatoare; 4.950 USD pe linie celulară și costul femelelor donatoare pentru alte medii genetice.
• comenzile locale, non-CWRU, vor fi taxate suplimentar cu 200 USD pentru ambalarea și transportul șoarecilor. Comenzile non-locale vor fi taxate cu 200 USD și costurile de transport.

conformitatea cu reglementările

• anchetatorii au nevoie de un protocol IACUC de la instituția lor pentru a primi șoareci din nucleu. Protocoalele CWRU IACUC trebuie să specifice utilizarea nucleului Transgenic al cazului. Anchetatorii nu au nevoie de un protocol IBC propriu, în mod normal: revizuirea ADN-ului recombinant la animale va fi efectuată pe baza informațiilor transmise prin comanda online pentru nucleul transgenic și va fi adăugată la Protocolul IBC al nucleului ca amendament dacă este aprobat. Puteți fi contactat de IBC pentru informații suplimentare ca parte a revizuirii ADNR după depunerea comenzii. Aprobarea IBC este necesară înainte de inițierea injecțiilor.

mulțumiri

• vă rugăm să recunoașteți cazul transgenic și facilitatea de direcționare în seminarii și publicații.

cronologie

• de la data injectării celulelor, vor fi minimum 6 săptămâni înainte de a vă putea livra șoareci (aproape 3 săptămâni pentru gestație și cel puțin 3 săptămâni de creștere postnatală înainte de înțărcare). Vor mai trece încă 6 săptămâni până când himerele masculine vor fi suficient de mari pentru a se reproduce și cel puțin încă 6 săptămâni înainte de a avea descendenți înțărcați la genotip pentru a testa transmiterea liniei germinale-un total de 4.5 luni de la injectare până la testarea transmiterii liniei germinale.
• timpul curent (3/25/21) așteptat între plasarea Comenzii și injectarea celulelor ES este de 8 săptămâni. În timpul celor 8 săptămâni anterioare injectării, cererea chimera este revizuită de Comitetul ADNR al IBC, celulele ES sunt dezghețate și crescute, iar șoarecii sunt ordonați și primiți.

rata de succes în generarea șoarecilor Himerici

nucleul generează în medie aproximativ 5 himere pe linie celulară.

Noțiuni de bază
probabilitatea transmiterii liniei germinale a unei mutații vizate este crescută odată cu numărul de linii celulare ES independente disponibile. În medie, aproximativ două treimi până la trei sferturi din liniile celulare ES pe fondul genetic 129 vor merge pe linia germinală. Pentru liniile celulare ES pe fundalul C57, o medie de doar o jumătate până la două treimi din linii va merge linia germinală. Prin urmare, dacă achiziționați linii de celule es direcționate dintr-un depozit public, vă recomandăm să achiziționați 3 sau mai multe linii direcționate corect pe fundalul 129 și 4 sau mai multe linii pe fundalul C57. De asemenea, comandați 2 sau mai multe injecții pentru 129 de linii și 3 sau mai multe pentru liniile C57. Pentru generarea de knockout-uri specifice țesuturilor cu alele condiționate în celulele ES de la EUCOMM, consultați grundul nostru.

Întrebări frecvente

ce sunt himerele?
de obicei, himerele sunt construite pentru a genera șoareci din linii celulare ES orientate spre gene sau prinse în gene. Celulele ES injectate în embrionii gazdă dau naștere șoarecilor mozaic cunoscuți sub numele de himere.
celulele es masculine sunt injectate în blastociste nesexate. Dacă embrionul gazdă este feminin și celulele es masculine produc celule germinale, himera va fi adesea un mascul fertil. Se folosesc embrioni gazdă dintr-o tulpină care nu va concura prea puternic cu celulele ES, iar cele două componente (ES și embrionul gazdă) sunt marcate genetic cu gene de culoare a stratului, astfel încât contribuția celulelor ES la animal poate fi determinată cu ușurință. Dacă proporția descendenților celulelor ES din stratul animalului este mare, probabilitatea ca celulele ES să fie reprezentate în gameți este de asemenea mare, deoarece celulele ES se amestecă bine cu celulele gazdă la începutul embriogenezei. Sistemul de marcare a culorii stratului permite, de asemenea, să se determine, cu cruci adecvate, dacă descendenții himerelor provin din componenta celulei ES sau din componenta embrionului gazdă.
129 de celule ES dau naștere culorii blanii maro, deoarece sunt A/A (agouti de tip sălbatic), iar embrionii gazdă C57BL/6j dau naștere culorii blanii negre, deoarece sunt A/a (nonagouti recesivi). Celulele ES provin din tulpina 129 a șoarecilor; embrionii gazdă provin din tulpina c57bl/6j a șoarecilor. Dacă aceste himere sunt crescute la șoareci a / a non-agouti (de exemplu C57BL/6j, atunci orice descendent brun (A/a) trebuie să fi apărut din gameți derivați din celule ES și se așteaptă ca 50% din descendenții maro să poarte alela knock-out. Alternativ, transmiterea mutației poate fi testată direct prin teste PCR sau Southern blot ale țesuturilor de la descendenți.

dacă celulele ES provin din tulpina C57BL/6j (a/a, Tyr/Tyr și negru), embrionul gazdă va fi albinos c57bl/6j (a/a, Tyrc-2J/Tyrc2-J și alb). Reproducerea unor astfel de himere la albino c57bl/6j poate genera descendenți Negri (a/a, Tyr/Tyrc-2J) din componenta celulei ES, din care 50% ar trebui să poarte mutația, și descendenți albi (a/a, Tyrc-2J/Tyrc-2J) din componenta embrionului gazdă.
himerele masculine care sunt susceptibile de a transmite mutația vizată pot fi identificate prin genotiparea dopului copulator.

himere pentru alte utilizări
de asemenea, facem himere de agregare și himere diploidtetraploide. Doi embrioni de preimplantare din două tulpini diferite de șoareci sunt combinați pentru a forma o himeră de agregare. Această tehnologie poate fi utilizată pentru a genera embrioni de mozaic genetic pentru analiza autonomiei și nonautonomiei acțiunii genelor și a altor obiective experimentale. În himerele diploidtetraploide, componenta tetraploidă dă naștere în mare parte unei mari părți a placentei derivate din embrion și a componentei diploide a embrionului. Acest tip de himeră poate fi utilizat pentru a determina dacă este necesară o genă în placentă sau embrion.

de ce sunt șoarecii mei culori amuzante?
unele linii celulare ES sunt heterozigote pentru alelele de culoare ale stratului care se dezvăluie doar în generațiile următoare. Celulele R1 129 ES pe care le folosim sunt heterozigote la locusul albino, purtând o copie a alelei chinchilla de albino (cch, denumită și Tyrc-ch) și sunt heterozigote la locusul de diluare cu ochi roz (p). Puii de reproducere descendenți din celulele R1 ES unul la celălalt pot da naștere șoarecilor care sunt negri, diferite nuanțe de gri, diferite nuanțe de maro sau galben, în funcție de sortimentul alelelor de culoare a stratului.

ce se poate face pentru a asigura transmiterea liniei germinale?
transmiterea liniei germinale este maximizată cu celule ES care au petrecut o perioadă minimă de timp în cultură, care au un complement normal de cromozomi și care nu conțin drojdie, bacterii și micoplasme. Vizați o linie celulară despre care știți că este transmisă în condițiile dvs. la instituția dvs. Utilizați o linie de celule parentale care se află la cel mai mic număr de pasaj disponibil (de preferință mai mic decât numărul de pasaj 16). Minimizați timpul în care linia vizată este cultivată. Verificați dacă liniile celulare vizate au numărul normal de cromozomi. Testați-vă linia celulară pentru micoplasmă. Unele linii celulare nu vor transmite chiar și atunci când toți acești parametri sunt în favoarea ta. Chiar și în condiții optime, doar două treimi din liniile celulare ES vizate vor fi transmise prin linia germinativă. Prin urmare, începeți cu cel puțin trei linii celulare independente vizate pentru a asigura transmiterea.

am himere slabe / himere feminine. Vor transmite knockout-ul?
atât himerele slabe, cât și himerele feminine pot transmite alele mutante, deși rareori. Himerele masculine care sunt susceptibile de a transmite mutația vizată pot fi identificate prin genotiparea dopului copulator. Doar aproximativ 10% din himerele feminine transmit genomul celulei ES, atunci când o fac, este doar în primele câteva pui, iar mulți dintre descendenții lor masculi au aneuploidii cromozomiale sexuale care îi fac infertili (Bronson și colab., 1995 PNAS 92, 3120).

de ce au murit cele mai puternice himere ale mele?
mortalitatea poate crește odată cu proporția animalului care provine din celulele ES, chiar și pentru cele mai bune linii celulare. Această mortalitate se datorează în mare parte aberațiilor epigenetice care au apărut în cultură. Se crede că aberațiile epigenetice sunt corectate prin reproducerea ulterioară a șoarecilor supraviețuitori și s-ar separa aleatoriu de locusul vizat, chiar dacă nu ar fi.

la ce tulpină de șoareci îmi cresc mutanții?
pentru a minimiza variabilitatea genetică cât mai repede posibil, reproduceți himerele în același fundal ca și celulele ES. Dacă celulele ES au fost 129, reproduceți himerele la 129 de șoareci și mutația dvs. va fi complet pe fundalul consangvinizat 129 într-un singur pas. Cel mai frecvent fundal consangvinizat pentru studiile genetice este tulpina C57BL/6. Dacă celulele ES sunt C57BL / 6, traversați himerele la șoareci c57bl/6j. Dacă doriți să schimbați fundalul, standardul este de a face 9 cruci seriale la tulpina consangvinizată la alegere (aproximativ 2,5 ani). Motivul pentru cele 9 generații este explicat aici de Lee Silver. Alternativ, aproximativ jumătate din numărul de generații este necesar de backcross asistat de marker sau de congenics de viteză.Pentru reproducere maximă, încrucișați șoarecii pe o tulpină de rasă, cum ar fi CD1. Șoarecii CD1 au fost derivați din șoareci elvețieni, au un grad ridicat de variație genetică și au fost selectați pentru reproducere robustă.

celule ES cu alele condiționate de la EUCOMM
fiecare linie celulară de la EUCOMM vă va solicita să încheiați un Acord de Transfer de materiale. Începeți acest proces cât mai curând posibil.
timpul de generare a șoarecilor și numărul de cruci necesare pentru a genera șoarecii experimentali se combină cu o perioadă de timp care este surprinzătoare pentru cei care nu sunt obișnuiți cu genetica șoarecilor, așa că planificați-vă înainte. Timpul de generare a șoarecilor (timpul de la adultul matur sexual la descendenții maturi sexuali) este de aproximativ 3 luni.
alelele condiționale EUCOMM au de obicei o casetă flancată de Frt (o casetă „Frt-ed”). Caseta are un acceptor de îmbinare care deviază practic toată îmbinarea în casetă, făcând alela o mutație a pierderii funcției în această configurație. Pentru a genera alela condiționată, caseta flancată de Frt trebuie îndepărtată prin trecerea la șoareci care exprimă Flpe. Sistemul Flpe / Frt este comparabil, dar distinct de sistemul Cre / loxp.
vom injecta celulele ES în embrioni gazdă pentru a face șoareci himerici. De acolo, veți reproduce șoarecii pentru a genera șoareci care transportă mutația (transmisia liniei germinale). Această generație fondatoare de șoareci poate fi încrucișată cu șoareci care exprimă Flpe pentru a elimina caseta Frt-ed, generând alela condiționată. Apoi, trebuie să faceți mai multe cruci pentru a genera șoarecii experimentali.

1. de la injectarea celulelor ES la himerele mature sexuale adulte este timpul de generare a șoarecilor (3 luni).
2. himerele sunt crescute la șoareci de tip sălbatic pentru a stabili mutantul în linia germinală (3 luni).
3. șoarecii condiționali heterozigoți frtd sunt încrucișați la homozigoți care exprimă flpe. Acest lucru generează Flpe/ o, FRTD condiționată / + urmași. (3 luni)
4. șoarecii condiționali Flpe/o, frtd/+ sunt încrucișați la tip sălbatic pentru a stabili alela excizată în linia germinală și a reproduce Flpe, iar excizia este verificată molecular la acești șoareci condiționali/+ (3 luni).
5. șoarecii condiționali/+ s-au crescut apoi între ei pentru a face șoareci homozigoți cu alelă condiționată (3 luni).
6. șoarecii condiționali/condiționali sunt crescuți la șoareci specifici țesutului-Cre/specific țesutului-Cre, null/+ pentru a face șoareci specifici țesutului experimental-Cre/o, condiționali/nuli și șoareci specifici țesutului de control-Cre/o, condiționali/+.

în plus, șoarecii Fple, null, Cre trebuie obținuți, șoarecii specifici țesutului-Cre/specific țesutului-Cre, null/+ trebuie crescuți.
de asemenea, alela condiționată trebuie analizată pentru a determina dacă este de tip sălbatic în funcție înainte de excizia cu Cre și null după excizia cu Cre. Pentru a determina dacă alela condiționată este de tip sălbatic în funcție înainte de excizie, mutanții condiționali/condiționali și condiționali/null ar trebui examinați pentru a determina dacă fenotipul lor este același cu șoarecii +/+ și, respectiv, null/+. Pentru a determina dacă condiționalul excizat este o alelă nulă, condiționalul este încrucișat cu un șoarece cre de linie germinală și Condiționalele excizate sunt intercalate pentru a testa dacă fenotipul condiționalului excizat/excizat este același cu null/null și/sau că nu se face nicio proteină din alela condiționată excizată.
un reporter al activității Cre precum RosaReporter, sau mai ideal, arătând direct că proteina de interes este absentă din celulele țintă prin imunofluorescență este un control important. RosaReporter generează Expresie permanentă beta-galactozidază în toate celulele care au fost expuse la Cre.
expresia excesivă a Cre poate duce la ruperea cromozomilor care poate provoca fenotipuri care nu au legătură cu funcția alelei condiționale. Prin urmare, șoarecii frați care exprimă Cre, dar păstrează o anumită funcție genică (de exemplu, condițional/+) sunt un control important.